CDK11家族激酶對PAK1的磷酸化調控及在細胞周期中的功能研究.pdf

1、經(jīng)典的CDK(cyclin dependent kinase)家族分子參與真核細胞的細胞周期調控。CDK11家族蛋白已發(fā)現(xiàn)三個成員:CDK11p110、CDK11p58和CDK11p46。CDK11p110廣泛表達于各個組織和細胞周期,主要參與轉錄調控和前體mRNA的剪切過程。CDK11p46是在某些凋亡信號刺激下,大的CDK11家族分子被剪切形成的含有C端激酶結構域的小分子,其功能與細胞凋亡信號的轉導有關。我們實驗室的研究發(fā)現(xiàn),在誘導

2、3T3細胞失巢凋亡的過程中,CDK11p46可被誘導表達,并且CDK11p46與PAK1(p21 activated kinase 1)分子相互結合并抑制了PAK1的激酶活性。進一步的研究證明PAK1被抑制之后,對BAD分子的抑制性磷酸化(Ser112和Ser136兩個絲氨酸位點)降低,從而BAD的線粒體轉位增加,造成細胞色素c的釋放,進而引起細胞凋亡。CDK11p46對PAK1的抑制作用和CDK11p46的激酶活性有關,激酶活性缺失的

3、D149N不能抑制PAK1激酶的活性和BAD的磷酸化狀態(tài),因此不能使細胞發(fā)生凋亡。CDK11p58是最早發(fā)現(xiàn)的CDK11家族成員,在β1-4半乳糖基轉移酶1的分離純化中得到,能磷酸化β1-4半乳糖基轉移酶1并對β1-4半乳糖基轉移酶1的活性起增強作用。CDK11p58在細胞內特異表達于G2/M期,過表達CDK11p58的細胞導致細胞生長緩慢,細胞周期變化,有絲分裂障礙,細胞阻滯于G2/M期。過表達CDK11p58能增強某些凋亡刺激造成的

4、細胞凋亡。cdc2L基因敲除的小鼠導致的早期胚胎凋亡中,伴隨有胚胎細胞有絲分裂停滯等現(xiàn)象,也提示了CDK11p58在真核細胞的有絲分裂過程中發(fā)揮很關鍵的作用。CDK11p58對有絲分裂紡錘體的組裝成熟和維持正常有絲分裂的進行起重要作用,進一步有人報道CDK11p58亦在維持姐妹染色單體的正常形態(tài)和正常分離發(fā)揮作用。雖然CDK11p58參與了有絲分裂M期的調控,但具體的分子機制尚不清楚。
　　 PAK1屬于一類絲/蘇氨酸蛋白激酶家

5、族p21 activated kinase family之一員,在各個組織廣泛表達并通過依賴或者不依賴于其激酶活性的方式參與調控一系列廣泛的生理過程和信號轉導途徑,比如細胞生存信號、增殖、細胞骨架動力學改變和細胞遷移、細胞周期調控、轉錄調控以及腫瘤發(fā)生等。有絲分裂M期細胞Pak1T212位磷酸化增強且胞內定位發(fā)生改變,T212磷酸化的PAK1主要定位于中心體附近,而與CDK11p58的M期定位大致相同。CDK11p58與PAK1之間的聯(lián)

6、系至今未有報道。我們的研究表明PAK1可作為CDK11p58激酶的體外底物。通過構建PAK1的缺失突變體和點突變體,我們發(fā)現(xiàn)研究表明絲氨酸174位是其體外的磷酸化位點。體內的磷酸化實驗亦證實CDK11p58可磷酸化修飾PAK1Ser174位點。通過定點誘變我們構建了模擬Ser174位點持續(xù)磷酸化和去磷酸化的突變體174E和174A。我們發(fā)現(xiàn)174E在細胞M期的定位類似于以前報道的野生型PAK1的定位,而174A失去了這種特異的定位形式。

7、進一步的研究表明相比174A,174E與DLC2(Dynein light chain 2)的結合明顯增強。體外的直接結合實驗也證實了CDK11p58激酶處理后的His-PAK1與DLC2的結合能力上升。DLC2在體內與myosinV形成蛋白復合物,通過年免疫共沉淀實驗我們同樣發(fā)現(xiàn)174E與myosinV復合物的結合也強于174A。這說明在細胞M期的進展過程中,CDK11p58激酶可能通過對PAK1Ser174位點的磷酸化修飾調節(jié)其亞細

8、胞定位。在進一步的功能研究中,我們構建了穩(wěn)定表達PAK1174E和174A的A375黑色素瘤細胞株,通過改良的MTT生長曲線測定我們發(fā)現(xiàn)同對照細胞株和174A穩(wěn)轉株相比,174E穩(wěn)轉細胞株的生長曲線變慢。用nocodazole阻滯上述A375穩(wěn)轉株于G2/M期,然后分別釋放,我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達174E的細胞細胞周期的進展明顯加快,而174A細胞株的細胞周期進展顯著減緩,這說明PAK1Ser174位點的磷酸化的精確調控對于維持正常的細胞周期

9、進展以及細胞的生長不可或缺。我們的實驗也提示了PAK1可作為CDK11p58M期特異的效應分子發(fā)揮作用。這將使我們對CDK11p5g和PAK1激酶的功能以及二者之間的聯(lián)系有進一步認識,有助于了解真核細胞M期調控的分子機制。
　　 為進一步研究CDK11家族成員與PAK1之間的關系,需要獲得大量具有生物學活性的和近似于體內修飾的蛋白。我們應用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng),首先體外構建了重組的表達His-CDK11p46和His-PAK1的