神經(jīng)細胞發(fā)育及缺血過程中磷酸化細胞周期相關(guān)蛋白的演變.pdf

1、第一部分磷酸化細胞周期相關(guān)蛋白在大鼠神經(jīng)元發(fā)育及衰老過程中的表達
　　 目的：細胞周期是細胞生命活動的基本過程，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)發(fā)育及衰老過程中神經(jīng)元上存在著細胞周期相關(guān)蛋白的廣泛表達，提示細胞周期相關(guān)蛋白具有調(diào)控細胞分裂之外的功能。而細胞周期相關(guān)蛋白的磷酸化在細胞周期調(diào)控中起著非常關(guān)鍵的作用，CDKs的磷酸化代表細胞周期的激活和細胞周期各時相之間的轉(zhuǎn)換，但目前為止尚無磷酸化細胞周期相關(guān)蛋白在神經(jīng)元發(fā)育及衰老過程中表達的報道。

2、為此，我們設(shè)計了本部分實驗，研究磷酸化細胞周期相關(guān)蛋白在大鼠神經(jīng)元發(fā)育及衰老過程中的表達。
　　 方法：選取正常生理狀態(tài)下的不同發(fā)育階段的大鼠作為研究對象，分別選取出生后1天(PN1d)、出生后11天(PN11d)、出生后1月(PN1m)、出生后3月(PN3m)、出生后15月(PN15m)的大鼠進行對比，運用免疫熒光技術(shù)檢測各年齡階段的大鼠皮層及海馬神經(jīng)元中磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb的表達，同時分離海馬，提取總蛋

3、白，運用Western-blot檢測海馬中磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb的蛋白含量。
　　 結(jié)果：(1)免疫熒光顯示NeuN 染色陽性所代表的神經(jīng)元的數(shù)量隨著年齡的增加而逐漸減少；(2)免疫熒光染色中皮層及海馬神經(jīng)元中陽性表達的磷酸化CDK2、磷酸化Rb 隨著年齡的增加而增加，在老年階段陽性率顯著增加；(3)Western-blot檢測提示隨著年齡的增加磷酸化CDK2、磷酸化Rb的蛋白含量逐漸增加；(4)磷酸化CDC

4、2在各年齡階段的免疫熒光染色中均無陽性表達，Western-blot 中顯示各年齡階段中磷酸化CDC2的蛋白含量均較低，且各組間無顯著性差異。
　　 結(jié)論：大鼠發(fā)育尤其是衰老時神經(jīng)元的磷酸化CDK2、磷酸化Rb 陽性表達增多提示部分神經(jīng)元細胞周期再次被激活，進入細胞周期的神經(jīng)元并未通過G2/M 調(diào)控點，而走向凋亡，提示細胞周期機制可能參與了衰老神經(jīng)元凋亡過程的調(diào)控。
　　 第二部分磷酸化細胞周期相關(guān)蛋白在局灶性腦缺血后神

5、經(jīng)細胞中的表達
　　 目的：局灶性腦缺血后神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞對于缺血的反應(yīng)不同，缺血導(dǎo)致神經(jīng)元壞死或凋亡，而星形膠質(zhì)細胞卻明顯增生。研究發(fā)現(xiàn)細胞周期機制參與了腦缺血后神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡以及星形膠質(zhì)細胞的增生，但目前的研究多集中在缺血后Cyclins和CDKI的表達上，尚無實驗顯示CDKs在腦缺血后神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)中的作用，而CDKs是細胞周期調(diào)控的核心機制。本實驗的目的就是為了明確CDKs在腦缺血后神經(jīng)細胞中的表達并對

6、比其在神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞表達的差異，以深入探討腦缺血損傷反應(yīng)的細胞周期機制。
　　 方法：應(yīng)用正常Wistar大鼠，參照Nagasawa 方法建立大鼠大腦中動脈阻塞模型(MCAO)，運用免疫熒光技術(shù)測定缺血灶周邊神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞中的磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb的表達。
　　 結(jié)果：(1)缺血后缺血中心區(qū)大部分神經(jīng)元死亡，而缺血周邊區(qū)神經(jīng)元形態(tài)多不規(guī)則；(2)正常對照組神經(jīng)元中僅見少量磷酸化CDK2、磷

7、酸化Rb的表達，而缺血后24h 磷酸化CDK2、磷酸化Rb的表達明顯增加，持續(xù)至缺血后3d，缺血后7d 至14d 時表達量與正常對照組無顯著性差異，磷酸化CDC2在正常對照組及缺血后各組間均無表達；(3)缺血后膠質(zhì)細胞明顯活化，在缺血后3d 膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)達到高峰；(4)正常對照組中星形膠質(zhì)細胞的磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb 僅有極少量表達，而缺血后24h 出現(xiàn)表達增加，在缺血后3d 表達量最多，缺血后7d 表達量下降，

8、而缺血后14d 星形膠質(zhì)細胞中磷酸化CDK2、磷酸化CDC2、磷酸化Rb的表達恢復(fù)至正常水平。
　　 結(jié)論：局灶性腦缺血后缺血灶周邊神經(jīng)元中磷酸化CDK2、磷酸化Rb的表達提示部分神經(jīng)元再次激活細胞周期，但未通過細胞周期G2/M 期控制點，提示再次進入細胞周期的神經(jīng)元并未完成整個細胞周期，而可能走向凋亡；而在星形膠質(zhì)細胞中，局灶性腦缺血后早期細胞周期被激活，代表G1/S 期的細胞周期蛋白磷酸化CDK2、磷酸化Rb和代表G2/M