雄激素受體基因CAG重復(fù)序列多態(tài)性及雄激素與動脈粥樣硬化關(guān)系的初步研究.pdf

1、男性冠心病的發(fā)病率和病死率均明顯高于同齡絕經(jīng)前女性。近年來有關(guān)雄激素在男性動脈粥樣硬化性疾病包括冠心病發(fā)病中的作用逐漸受到關(guān)注。有研究顯示，男性冠心病患者血循環(huán)睪酮水平明顯降低；長期口服高劑量睪酮制劑或經(jīng)皮補(bǔ)充低劑量睪酮可改善男性心絞痛癥狀積分和心肌缺血的客觀指標(biāo)；在男性冠心病患者冠脈內(nèi)注入生理濃度睪酮可增加冠脈直徑和冠脈內(nèi)血流；動脈粥樣硬化好發(fā)于老年男性，而老年男性睪酮水平明顯降低，提示睪酮與動脈粥樣硬化之間存在關(guān)聯(lián)。匯總，臨床流行病

2、學(xué)研究的結(jié)果，沒有研究支持睪酮與冠心病的正相關(guān)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的OX-LDL氧化損傷是動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中重要的始動環(huán)節(jié)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在心房、心室肌纖維、動脈內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞均有雄激素受體(AR)表達(dá)。雄激素只在AR存在的靶組織中才能行使其生物學(xué)功能，雄激素作用的強(qiáng)弱與細(xì)胞內(nèi)AR含量密切相關(guān)。研究顯示，AR的表達(dá)和功能受AR基因外顯子1區(qū)(CAG)n多態(tài)性的調(diào)控。因此要研究雄激素對動脈粥樣硬化的影響，AR是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而AR基因(C

3、AG)。多態(tài)性與雄激素和冠心病的關(guān)系并不明確。本研究旨在通過對雄激素-雄激素受體-動脈粥樣硬化三者之間關(guān)系的研究，以及雄激素受體基因CAG多態(tài)性對AR表達(dá)影響的研究，從基因和細(xì)胞水平探討AR在動脈粥樣硬化中發(fā)揮的作用。 目的： (1)研究AR基因(CAG)n多態(tài)性對AR mRNA和AR蛋白表達(dá)的影響； (2)研究不同濃度的睪酮預(yù)處理對ECV304氧化損傷后NO、PAI-1、ICAM-1、PDGF-B和TGF-β1

4、的變化，探討睪酮在動脈粥樣硬化中可能的作用機(jī)制。 (3)研究含不同CAG重復(fù)數(shù)AR基因的ECV304氧化損傷后，睪酮干預(yù)治療作用的差別。 方法： (1)以pwtAR質(zhì)粒和已鑒定CAG重復(fù)數(shù)的白細(xì)胞基因組DNA為基礎(chǔ)，通過重組PCR、酶切、連接等方法構(gòu)建含CAG重復(fù)數(shù)為0，8，21，34的AR表達(dá)質(zhì)粒； (2)將含CAG重復(fù)數(shù)0，8，21，34的AR表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，TRIZOL提取總RNA，用

5、于RT-PCR檢測AR mRNA；細(xì)胞裂解液提取總蛋白，用于Western Blot檢測AR蛋白。分析并比較不同的CAG重復(fù)對AR轉(zhuǎn)錄及翻譯的影響； (3)MTT法檢測不同濃度睪酮干預(yù)對ECV304細(xì)胞增殖的影響，連續(xù)觀察96h； (4)RT-PCR比較不同濃度睪酮干預(yù)后ECV304細(xì)胞AR mRNA水平的差別； (5)ECV304細(xì)胞分組，分別加入OX-LDL、不同濃度睪酮預(yù)處理+OX-LDL和氟他胺(Flu，

6、AR拮抗劑)預(yù)處理+OX-LDL，孵育30h后，收集培養(yǎng)液上清，硝酸還原酶法檢測NO，ELISA法檢測PAI-1；收集細(xì)胞加裂解液提取蛋白，Western Blot檢測ICAM-1、PDGF-B和TGF-β1； (6)將含CAG重復(fù)數(shù)0，8，21，34的AR表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞，之后用OX-LDL氧化損傷12h，加不同濃度的睪酮干預(yù)24h，按照步驟(5)中的方法檢測相應(yīng)指標(biāo)。 結(jié)果： (1)成功構(gòu)建了含C

7、AG重復(fù)數(shù)為0，8，21，34的AR表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序和序列比對，證實(shí)插入片段的大小、方向、閱讀框和CAG重復(fù)長度正確； (2)CAG重復(fù)數(shù)與AR mRNA和蛋白水平之間的關(guān)系：對AR mRNA，CAG0最低，CAG34居中，CAG8和CAG21最高；對AR蛋白，CAG8最低，CAG34居中，CAG0和CAG21最高。二者的變化并不一致； (3)低生理及生理濃度(3～30nM)的睪酮對內(nèi)皮細(xì)胞的生長無不良影響；而超生

8、理濃度睪(3μM-30μM)36h后，高生理濃度睪酮(300nM)48h后內(nèi)皮生長速度減慢。隨著睪酮作用時間的延長差別越發(fā)明顯，生長曲線增長幅度明顯變緩； (4)ECV304細(xì)胞AR mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨睪酮濃度的增加而增加，在低～高生理濃度范圍(3nM～300nM)內(nèi)基本一致，在超生理濃度(3～30μM)表達(dá)量進(jìn)一步增加； (5)不同濃度睪酮預(yù)處理對OX-LDL氧化損傷ECV304細(xì)胞后各指標(biāo)檢測的結(jié)果：OX-LDL引起

9、NO、TGF-β1表達(dá)降低，PAI-1、ICAM-1和PDFGF-B表達(dá)增加；與OX-LDL組相比，T3nM和T30nM預(yù)處理除對PAI-1和ICAM-1表達(dá)無逆轉(zhuǎn)作用外，PDGF-B進(jìn)一步降低，而在NO和TGF-β1的影響上前者繼續(xù)下降，后者有增加作用；T300nM～30μM作用相似，對ICAM-1和PDGF-B有抑制作用，對TGF-β1有促進(jìn)作用，但T3～30μM對NO和PAI-1的變化無明顯逆轉(zhuǎn)；Flu預(yù)處理對PAI-1無明顯影響

10、，對其他OX-LDL損傷指標(biāo)的變化有拮抗作用； (6)ECV304細(xì)胞轉(zhuǎn)染pAR-CAGn的效果不理想，未能就AR基因(CAG)n多態(tài)性對氧化損傷的內(nèi)皮細(xì)胞(動脈粥樣硬化模型)的影響作更加深入的研究。 結(jié)論： (1)重組PCR是可行的、有效的基因重組和基因缺失突變方法； (2)在本研究所選取的CAG重復(fù)數(shù)上，未發(fā)現(xiàn)CAG重復(fù)數(shù)(0，8，21，34)與AR mRNA和蛋白水平之間的線性關(guān)系，在CAG21的A

11、R mRNA和蛋白表達(dá)量均較高，與人群中CAG重復(fù)數(shù)的中位數(shù)相近； (3)超生理濃度睪酮對ECV304的細(xì)胞增長有明顯的抑制作用； (4)睪酮對ECV304 AR mRNA的表達(dá)有劑量依賴性增加的作用； (5)低生理濃度睪酮對氧化損傷的ECV304無保護(hù)作用，而生理濃度、高生理濃度和超生理濃度的睪酮對氧化損傷的ECV304保護(hù)的機(jī)制不盡相同。氟他胺(AR拮抗劑)對氧化損傷的ECV304也有保護(hù)作用，確切的機(jī)制不明