HR對(duì)核受體VDR靶基因調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、近年來(lái),隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展,Jumonji蛋白家族(JmjC-domain-containingproteins)的許多成員相繼被鑒定為組蛋白賴氨酸去甲基化酶(histone lysinedemethylase,KDM),它們是染色質(zhì)伴隨蛋白(chromatin-associated protein),在染色質(zhì)水平調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與其它過(guò)程。Hairless(Hr)是這個(gè)家族中的一個(gè)成員,生物信息學(xué)分析顯示HR不太可能是一個(gè)組蛋白賴氨酸

2、去甲基化酶。但是令人矚目的是,Hr基因的點(diǎn)突變?cè)谌撕托∈蠖紩?huì)導(dǎo)致毛發(fā)的生長(zhǎng)缺陷,表明HR蛋白有著重要的生物學(xué)功能。有報(bào)道表明HR參與調(diào)控核受體(nuclear receptor)2 VDR、TR等的靶基因及與WNT通路功能相關(guān),但其中的作用機(jī)制并不明確。已知VDR的表達(dá)缺陷和WNT通路的功能異常也會(huì)導(dǎo)致毛發(fā)的生長(zhǎng)缺陷,因此闡明HR與核受體VDR及WNT通路的功能關(guān)系,將有助于為這類疾病的治療提供生化依據(jù)。HR蛋白在細(xì)胞內(nèi)作用方式的闡明對(duì)

3、解析Jumonji家族其它蛋白的功能亦會(huì)有所幫助。
　　 本文主要探討了HR對(duì)核受體VDR靶基因的調(diào)控方式,并簡(jiǎn)單觀察了HR對(duì)WNT通路的作用。
　　 1.通過(guò)RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)了Hairless基因在幾種人的不同組織來(lái)源的細(xì)胞系的表達(dá),發(fā)現(xiàn)HR在皮膚來(lái)源的細(xì)胞系如HaCaT和HeLa細(xì)胞及神經(jīng)來(lái)源的細(xì)胞系如SH—SY5Y細(xì)胞表達(dá)較高,在人胚腎細(xì)胞293T亦有表達(dá),在橫紋肌來(lái)源的RD細(xì)胞幾乎不表達(dá)。
　

4、　 2.免疫熒光顯示在293T細(xì)胞,外源表達(dá)的flag-HR主要分布在細(xì)胞核內(nèi),而且不是均勻分布的。構(gòu)建了全長(zhǎng)的人HR與EGFP的融合表達(dá)質(zhì)粒,在MCF7和293T細(xì)胞內(nèi)觀察到,在細(xì)胞分裂間期,HR在細(xì)胞核內(nèi)表現(xiàn)為三種分布狀態(tài),均勻分布、完全的點(diǎn)狀和介于兩者之間的形態(tài)；在分裂期,HR的分布狀態(tài)與紡錘體形狀頗為相似,表現(xiàn)為在細(xì)胞核外的兩個(gè)對(duì)稱位置有熒光信號(hào)的密集分布,并且兩者之間有點(diǎn)狀的熒光信號(hào)連接。
　　 3.克隆了人和大鼠的

5、CYP24A1啟動(dòng)子,發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HR對(duì)人和大鼠的CYP24A1啟動(dòng)子活性均有抑制作用,并且在用不同濃度的1,25(OH)2D3誘導(dǎo)或不加藥誘導(dǎo)時(shí),抑制作用均存在。
　　 4.克隆了人的RARB啟動(dòng)子,發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HR對(duì)RARB啟動(dòng)子的活性有較小的激活作用,這種作用在用10uM的ATRA誘導(dǎo)或不用藥誘導(dǎo)時(shí)均存在。
　　 5.通過(guò)對(duì)大鼠的CYP24A1啟動(dòng)子的刪切實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)HR對(duì)CYP24A1啟

6、動(dòng)子活性的抑制與VDRE序列密切相關(guān)。
　　 6.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)提示HR與VDR蛋白之間有相互作用。
　　 7.HeLa細(xì)胞中雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,20nM trichostatin A(TSA,Ⅰ和Ⅱ類HDAC抑制劑),20mM Nicotinamide(NAM,Ⅲ類HDAC抑制劑)、20uM adenosinedialdehyde(Adox,甲基轉(zhuǎn)移酶的間接抑制劑)和10uM5-Aza-2’-deoxycytidine

7、(5-Aza-dC,DNA甲基化的抑制劑)均不能解除HR對(duì)CYP24A1啟動(dòng)子活性的抑制作用,提示HR的功能不是通過(guò)改變組蛋白的乙?；揎?或者組蛋白和DNA的甲基化修飾實(shí)現(xiàn)的。
　　 8.染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示,HR在HeLa細(xì)胞的高表達(dá)沒(méi)有改變CYP24A1啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(-83/142)和上游(-1056/-863)區(qū)域組蛋白H3K4Me3、H3K9Me3、H3K27Me3、H3K4Me2的修飾狀態(tài),進(jìn)一步證明了HR

8、的功能不是通過(guò)改變組蛋白的甲基化修飾實(shí)現(xiàn)的。
　　 9.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)提示在HeLa細(xì)胞,外源表達(dá)的HR與內(nèi)源的核受體共抑制蛋白NcoR1(nuclear receptor corepessor)、msin3A蛋白有相互作用；熒光顯微鏡觀察到EGFP-HR與Cherry-NcoR1(756-2528aa)在293T細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位一致;HR的免疫共沉淀蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中NcoR的肽段覆蓋率為13％,三者結(jié)合可以提示HR與NcoR

9、1蛋白在一個(gè)復(fù)合體中。
　　 10.激光共聚焦顯微鏡觀察到EGFP-HR與Cherry-ASH2L和Cherry-HP1α在293T細(xì)胞核內(nèi)的定位呈互補(bǔ)分布,提示HR與ASH2L蛋白(被認(rèn)為常常結(jié)合于活化的染色質(zhì)區(qū))和異染色質(zhì)蛋白HP1α在細(xì)胞核內(nèi)分布于不同的區(qū)室。
　　 11.EGFP-HR與Cherry-VDR在293T和MCF7的亞細(xì)胞定位一致,結(jié)合以上結(jié)果,提示了HR對(duì)VDR的靶基因的抑制作用的可能機(jī)制。