法樂四聯(lián)癥相關基因的研究.pdf

1、第一部分：法樂四聯(lián)癥相關基因的篩選與鑒定 目的：通過比較法樂四聯(lián)癥患兒心肌與發(fā)育正常心肌組織間的全基因組表達譜差異，進一步揭示法樂四聯(lián)癥發(fā)生、發(fā)展的內在分子機制。 方法：采用含21 329條Oligo DNA的人類全基因組寡核苷酸表達譜芯片，對5例法樂四聯(lián)癥息兒心肌組織與5例發(fā)育正常的心肌組織配對檢測差異表達基因，通過生物信息學分析，我們將上述差異表達基因進行分類并挑選出了與法樂四聯(lián)癥發(fā)生相關的差異表達基因，并采用實時定

2、量PCR及免疫組化技術在更多樣本中驗證芯片的結果。鑒于與本組法樂四聯(lián)癥患兒年齡相匹配的正常心肌組織難以獲取，在基因芯片的實驗過程中我們采用了發(fā)育正常引產胎兒心肌組織作為對照，為彌補芯片實驗中由于年齡不匹配及手術因素對實驗結果的影響，在接下來的實時定量PCR及免疫組化驗證實驗中我們采用了法樂四聯(lián)癥患兒心肌、發(fā)育正常胎兒心肌、與TOF患兒年齡匹配的單純室間隔缺損患兒心肌及發(fā)育正常的成人心肌組織各10例來進一步驗證芯片結果。 結果：共

3、有242個基因在全部5張基因芯片中存在共同的差異表達，依據(jù)上述基因所參與的主要的生物學過程，我們將上述242個基因分為13類，在“發(fā)育相關基因”中我們發(fā)現(xiàn)圓錐動脈干畸形候選基因CSPG2與NTRK3的表達在TOF組患兒中存在明顯的表達減低，在接下來的擴大樣本量的實時定量PCR和免疫組織化學實驗中我們發(fā)現(xiàn)NTRK3基因的表達在mRNA水平和蛋白水平TOF組患兒中均特異性表達減低，而CSPG2基因的表達則隨年齡的增加而增加。 結論：

4、我們的研究結果提示，NTRK3基因的表達減低可能與人類法樂四聯(lián)癥右心室流出道畸形的發(fā)生，發(fā)展相關。 第二部分法樂四聯(lián)癥候選致病基因HEY2突變的初步分析 目的：探討中國法樂四聯(lián)癥患兒HEY2基因突變的情況。 方法：法樂四聯(lián)癥患者52例，其中男性30例，女性22例，年齡5.74±2.50(3個月～9歲)，均為我院小兒外科中心住院患兒，其中心臟畸形為單發(fā)法樂四聯(lián)癥患者38例，伴發(fā)其他心臟畸形14例，其中5例合并動脈導

5、管未閉+房間隔缺損，2例合并動脈導管未閉，2例合并卵圓孔未閉，1例合并房間隔缺損，合并單發(fā)右位心，單冠畸形、左肺動脈缺如、永存左上腔靜脈患者各1例。經心臟超聲檢查和(或)心導管、心外科手術明確診斷。所有研究對象無血緣關系，均行全面完整的體格檢查，合并其他心外畸形患兒在本研究中予以排除，以除外綜合征型TOF患兒。50例健康人作為正常研究對照。征得患兒家長同意后，抽取患兒外周血3mL，以EDTA抗凝，-70℃保存，常規(guī)胍鹽酸法抽提基因組DN

6、A，應用遞減聚合酶鏈反應結合DNA測序技術對上述患兒及對照者的HEY2基因全部外顯子及其側翼序列進行突變檢測及單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析，對所發(fā)現(xiàn)的突變位點或單核苷酸多態(tài)性位點在患者和健康人中的分布進行比較。 結果：本組52例患者中，未發(fā)現(xiàn)可引起氨基酸序列改變的突變位點，但我們發(fā)現(xiàn)了2個新的雜合性突變位點：1例患者的cDNA 621位堿基為A→T雜合性突變，但其編碼的氨基酸未發(fā)生改變，仍然為絲氨酸，為同義突變，另外，在3例患者