VEGF基因多態(tài)性及Id2基因甲基化與患兒法洛四聯(lián)癥的相關(guān)性研究.pdf

1、先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)簡稱先心病，由胚胎時期胎兒的心血管系統(tǒng)發(fā)育異常引起，表現(xiàn)為心臟和血管在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能、代謝等方面的異常，是常見的新生兒出生缺陷性心血管疾病。法洛四聯(lián)癥(tetralogy ofFallot，TOF)是紫紺型先天性心臟病最常見的一種畸形，它具有四個明顯的特征:室間隔缺損、主動脈騎跨、肺動脈狹窄和右心室的肥厚。研究顯示，TOF的發(fā)病率為1‰，占全部CHD病人的十分之一

2、，嚴(yán)重影響患兒的健康以及生命。TOF的確切發(fā)病原因尚不清楚，研究報道，遺傳因素和一些環(huán)境因素在疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均起到了一定的作用，而遺傳因素為主要因素。TOF的遺傳學(xué)發(fā)生機(jī)制不能僅僅以基因突變來解釋，也可能涉及表觀遺傳修飾改變的積累過程。
　　血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種特異地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的促有絲分裂原，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、新生血管形成以及增加

3、微血管通透性等功能，在心臟、大血管及瓣膜形成的一系列胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是在基因組水平上由某一個核苷酸的改變所引起的DNA序列的多態(tài)性變化，與人體許多表型的差別、對藥物敏感性或疾病的易感性均有關(guān)聯(lián)，是目前基因多態(tài)性的研究熱點。VEGF基因存在大量多態(tài)位點，這些SNPs有可能通過轉(zhuǎn)錄和翻譯對VEGF的表達(dá)水平產(chǎn)生影響，進(jìn)而對疾病易感性造成影響

4、。研究顯示，VEGF是第一個被發(fā)現(xiàn)的TOF修飾基因，與TOF的發(fā)生密切相關(guān)。
　　DNA結(jié)合抑制蛋白2或細(xì)胞分化抑制蛋白2(inhibitor of DNA binding orinhibitor of differentiation2，Id2)是一種細(xì)胞分化抑制蛋白，參與了心臟發(fā)育的多個階段的調(diào)控，其中包括:心肌生成、神經(jīng)發(fā)生、細(xì)胞生長和細(xì)胞的分化過程。動物實驗中發(fā)現(xiàn)在心臟發(fā)育過程中，Id2在心臟神經(jīng)嵴、第二心域、心室流出和流入

5、道及前副交感神經(jīng)叢中均有表達(dá)。甲基化是基因組DNA的一種主要表觀遺傳修飾形式，是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段，它通過在轉(zhuǎn)錄水平上來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)該基因編碼蛋白的表達(dá)。但迄今為止，關(guān)于VEGF基因多態(tài)性和Id2基因甲基化與TOF發(fā)病的關(guān)系很少有報道。
　　目的：
　　本研究主要分為兩個部分，第一部分是VEGF基因多態(tài)性與法洛四聯(lián)癥相關(guān)性的研究，目的是通過對漢族兒童VEGF基因9個多態(tài)位點（-2578C/A、-460T

6、/C、-1154G/A、-634G/C、534C/T、+398G/A、+936C/T、752C/T、913G/A）進(jìn)行基因分型，進(jìn)一步探討9個SNPs與法洛四聯(lián)癥發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性，為TOF的產(chǎn)前基因篩查、基因診斷和治療提供理論依據(jù)。
　　本研究的第二部分是Id2基因甲基化與法洛四聯(lián)癥的相關(guān)性研究，通過檢測TOF組和對照組兒童血液中Id2基因甲基化程度，以及檢測外周血紅細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)，分析Id2基因的甲基化與法洛四聯(lián)癥患者的關(guān)系，初步

7、探討Id2基因的甲基化在法洛四聯(lián)癥發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，以期為TOF的表觀遺傳學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分研究:基于病例-對照研究方法，采用飛行質(zhì)譜分析技術(shù)對165例TOF患兒(TOF組)和240例健康兒童（對照組）的VEGF基因的9個位點(-2578C/A、-460T/C、-1154G/A、-634G/C、534C/T、+398G/A、+936C/T、752C/T、913G/A)進(jìn)行基因分型。計算和比較

8、在等位基因模型、顯性和共顯性遺傳模型下各組基因型頻率、等位基因頻率、比值比(odds ratio，OR)及95％可信區(qū)間(confidence internal，CI)，分析VEGF基因9個SNPs位點與TOF的相關(guān)性，用Haploview4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡及單倍體型分析。
　　第二部分研究:本研究采用飛行質(zhì)譜測序的方法分別檢測TOF組31例和對照組32例兒童血液中Id2基因的甲基化狀態(tài)，分析Id2基因甲基化程度與TOF發(fā)病

9、的關(guān)系。使用全血細(xì)胞分析儀檢驗外周血紅細(xì)胞指標(biāo)，比較兩組測定結(jié)果與Id2基因甲基化的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　第一部分 漢族兒童VEGF基因多態(tài)性與法洛四聯(lián)癥發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性研究
　　1、-2578C/A(rs699947)和+936C/T(rs3025039)純合突變基因型會增加TOF的發(fā)病風(fēng)險(P=0.020;P=0.017);
　　2、攜帶A位點的-1154G/A(rs1570360)會增加TOF的發(fā)病風(fēng)險

10、(P＜0.001);
　　3、與GG基因型相比，-634G/C(rs2010963)位點的GC基因型能增加TOF的發(fā)病風(fēng)險(P=0.007)，但CC基因型未見顯著差異（P＞0.05）;
　　4、其余5個SNPs與TOF之間未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(P＞0.05);
　　5、單體型分析顯示，與最常見的單體型相比，單體型塊1中的CCA和ATA（-2578C/A、-460T/C和-1154G/A）與單體型塊3中的TTG和TCA（+936

11、C/T、752C/T和913G/A）可顯著增加TOF的發(fā)病風(fēng)險(P＜0.05)。
　　第二部分 Id2基因甲基化與法洛四聯(lián)癥發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性研究
　　1、甲基化分析結(jié)果顯示，對照組與TOF組的Id2基因甲基化水平相比，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，Id2基因甲基化可能不會增加TOF的發(fā)病風(fēng)險(P＞0.05);
　　2、相關(guān)性分析顯示，在控制了年齡、身高、體重和性別4個變量因素后，紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞比積和平均紅細(xì)胞體積與

12、Id2基因各位點甲基化水平之間均無相關(guān)性(P＞0.05);平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量和平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度與Id2基因的CpG_16、CpG_18.19單位甲基化水平均呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.337，P=0.009;r=-0.392，P=0.002;r=-0.363，P=0.005; r=-0.286，P=0.028)。
　　結(jié)論：
　　1、VEGF基因-2578C/A、-1154G/A、-634G/C、+936G/A4個SNP

13、s位點多態(tài)性與TOF的易感性相關(guān)聯(lián);
　　2、VEGF基因-2578C/A、-460T/C和-1154G/A3個SNPs位點及+936C/T、752C/T和913G/A3個SNPs位點分別表現(xiàn)出連鎖關(guān)系，其中單體型CCA和ATA與單體型TTG和TCA與TOF的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān);
　　3、TOF組與對照組的Id2基因甲基化水平相比，沒有統(tǒng)計學(xué)差異，提示Id2基因甲基化程度與TOF發(fā)病可能沒有相關(guān)性;
　　4、Id2基因各