蛛網膜下腔出血的基礎和臨床研究.pdf

1、本研究旨在從分子生物學和臨床的角度探討腦蛛網膜下腔出血（SAH）發(fā)病機制，為臨床制定確實有效的治療方案，改善SAH病人的預后提供依據(jù)。 第一部分、蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣與內皮-氧化氮合酶基因多態(tài)相關研究。 目的：探討內皮一氧化氮合酶基因的已知多態(tài)與蛛網膜下腔出血后發(fā)生腦血管痙攣的相關性。 方法： 1.實驗分組：SAH無CVS組、ASAH有CVS組、TSAH有CVS組，其中ASAH有CVS組和TSAH有

2、CVS組為實驗組（98+96=194例）、SAH無CVS組為對照組（195例）。以家系為基礎的相關性研究，為實驗組194例和對照組100例。 2.全部病人均作如下檢查：包括3D-DSA、CT和TCCD檢查。分別探測頸外動脈、頸內動脈、大腦前動脈、大腦中動脈、大腦后動脈、基底動脈、椎動脈。分別記錄各腦動脈的收縮峰血流速度，平均血流速度，舒張末期血流速度。三組病人均在出血后的第3天和第7天各檢測上述指標1次。 3.抽血檢查病

3、人DNA，采用兩對引物：決定T-786C含223個堿基對片段的多態(tài)的引物： 上游引物是5’-GCATGCACTCTGGCCTGAAGTG-3'， 下游引物是5’-CAGGAAGCTGCCTTCCAGTGC-3’； 決定外顯子7內含267個堿基對G894T的置換的片段的引物： 上游引物是5'CTGGAGATGAAGGCAGGAGAC-3' 下游引物是5’-CTCCATCCCACCCAGTCAATC-

4、3'。 通過聚合酶鏈反應（PCR）擴增：聚合酶鏈反應（PCR）是在50μl的總容積內含80 ng染色體DNA、50pmol的每種引物、200 μmol/L dNTP、1.25U的TAQ FLDNA聚合酶（PGC Scientific Co.，F(xiàn)rederick，MD，USA）和5μl的10 ×PCR buffer緩沖液含15 mmol/L MgCl2（PGC Scientific Co.）。開始的變性溫度為94℃反應5分鐘、隨

5、后循環(huán)40次在94℃的條件下反應1分鐘、55℃反應1分鐘和77℃1分鐘。在72℃下延伸5分鐘使擴增完成。擴增后進行印跡：8微升的PCR擴增產物加入50μL的變性溶液[500 mmol/L NaOH、2.0 mol/L NaCl、25 mmol/L乙二胺四醋酸（EDTA）、0.0001%溴酚藍]并在真空條件下將其轉移到一個點印器具上的尼龍膜。轉移后將膜浸入2 × NaCl/枸櫞酸鈉溶液80℃下20分鐘吸干。并通過決定T-786C多態(tài)采用兩

6、個17個堿基對的等位基因特異的寡核苷酸探針：序列為5’-CTGGCCGGCTGACCCTG-3’和5'CTGGCTGGCTGACCCTG-3’決定G894T多態(tài)采用兩個17個堿基對的等位基因特異的寡核苷酸探針，序列如下：5’-GATGAGCCCCCGAACT-3’和5'GATGATCCCCCGAACT-3’進行雜交，檢測內皮一氧化氮合酶基因的多態(tài)即基因型和等位基因頻率。 4.進行病例對照研究，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計

7、分析：連續(xù)變量比較采用T檢驗。在對照組和兩個病例組基因型和等位基因頻率比較采用標準卡方檢驗。根據(jù)Rothman的方法或分層卡方檢驗計算其優(yōu)勢比和其可信區(qū)間。 結論：內皮一氧化氮合酶的DNA序列的差異與蛛網膜下腔出血后腦血管痙攣的發(fā)生有相關性。 第二部分、吸煙對動脈瘤性蛛網膜下腔出血病人腦循環(huán)影響的研究。 目的：探討內皮一氧化氮合酶基因對吸煙的動脈瘤性蛛網膜下腔出血病人的腦循環(huán)的影響。 方法：根據(jù)吸煙量（每

8、年吸煙的量）≥200支和0支分為吸煙組和不吸煙組，其中吸煙組198例，不吸煙組196例。 1.全部病人夜間禁食后收集血漿來測量總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯水平。 2.進行TCCD檢測：分別探測頸內動脈（ICA）、大腦中動脈（MCA）。分別記錄各腦動脈的收縮峰血流速度（Vs），平均血流速度（Vm），舒張末期血流速度（Vd）。三組病人均在出血后的第3天和第7天各檢測上述指標1次。以公式：Vm=Vs+（Vd×2）/3計算平

9、均流速。 3.從外周血中提取DNA，以 C0：TTT CTC CAG CCC CTC AGA TG； 2684C：GGC AGA GGC AGG GTC AGA CG 2684T：CAT CAA GCT CTT CCC TGT CT T0：AGG CCC AGC AAG GAT GTA GT為引物，采用等位基因特異性聚合酶鏈反應擴增：在總容積20ul：包括50ng基因組DNA、0.25μmol/L

10、 2684T和2684C啟動子、0.063 μmol/L T0和C0啟動子、62.5 μmol/L dNTPs、45 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、11 mmol/L硫酸銨、 6.7 μmol/L，β-巰基乙醇、 4.5 μmol/L EDTA、1.5mmol/L MgCl2、和0.4 U Taq聚合酶。起始溫度為96℃，在94℃下30秒、60℃下30秒、72℃下20秒循環(huán)35次完成擴增。將內皮一氧化氮合酶基因的T

11、-786C多態(tài)進行基因分型。通過尿中F2-異前列烷排泄物來評估吸煙者的氧化應激。 4.采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。 結論：內皮一氧化氮合酶基因可改變吸煙的動脈瘤性蛛網膜下腔出血病人的腦循環(huán)，使腦血流速度增高。 第三部分、結合珠蛋白遺傳多態(tài)性與動脈瘤性蛛網膜下腔出血的相關性探討。 目的：探討動脈瘤性蛛網膜下腔出血病人血中結合珠蛋白（Hp）表型和Hp基因頻率的分布及其與病情嚴重程度之間的關系。

12、 方法：分為實驗組和對照組，其中實驗組病人197例，其中98例ASAH發(fā)生腦血管痙攣及99例未發(fā)生腦血管痙攣，即又分為未痙攣組和痙攣組，年齡28～79歲，平均年齡（39.9±14.8）歲，已排除有明顯高血壓、糖尿病、心臟病的病人；對照組195例正常人，年齡27～79歲，平均年齡（38±15.3）歲，無高血壓、糖尿病、心腦血管病。其中痙攣組根據(jù)腦血管痙攣的程度分三分級。同時采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳技術檢測197例SAH病人和1

13、95例正常對照者血中Hp表型的分布。 結論：血清有Hp2-1和Hp2-2的人群可能對腦血管痙攣有遺傳易感性。Hp2基因在未痙攣組和痙攣組病人中有聚集現(xiàn)象，與其遺傳易感性增高有某種內在聯(lián)系，可能在CVS發(fā)病及發(fā)展中起一定作用。 第四部分、載脂蛋白E基因多態(tài)性與動脈瘤性蛛網膜下腔出血的相關性研究。 目的：探討載脂蛋白E（APOE）基因多態(tài)與動脈瘤性蛛網膜下腔出血（ASAH）及腦血管痙攣（CVS）間的相關程度。

14、 方法： 1.研究對象及分類評估：實驗組SAH病人，共197例，98例發(fā)生腦血管痙攣（CVS）及99例未發(fā)生腦血管痙攣，年齡28～79歲，平均年齡（39.9±14.8）歲，已排除有明顯高血壓、糖尿病、心臟病的病人；正常對照組195例，年齡27～79歲，平均年齡（38±15.3）歲，無高血壓、糖尿病、心腦血管病。所有病人在入院時進行頭顱CT掃描并根據(jù)Fisher分級、Hunt and Hess分級及世界神經外科醫(yī)師聯(lián)盟（WFNS）

15、臨床分級評分進行分類；術后6個月參照格拉斯哥預后評分（GOS）判斷預后。 2.標本采集：所有入選病人禁食12 h后，抽清晨空腹血5 ml，其中2 ml血（EDTA抗凝）常規(guī)提取DNA進行APOE基因多態(tài)性分析；3ml血測定血脂、血糖等生化指標。 3.血脂和載脂蛋白測定：血標本采集后，在同一臺全自動生化分析儀進行總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）、載脂蛋白A（ApoA

16、）與載脂蛋白B（ApoB）測定。 4.基因組DNA提?。禾崛⊥庵苎蚪MDNA作為PCR擴增模板，引物上游序列為：5’-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3’，引物下游序列為：5’-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGCCA-3'。 5.PCR擴增及Cfol內切酶消化：PCR擴增在20μl反應體系中進行，其中包括基因組DNA 200 ng，引物10pmol/L，4×dNTP各100μmo

17、l/L，氯化鎂2.5 mol/L，二甲基亞砜10% （V/V），TaqDNA聚合酶1U，并加入1滴礦物油覆蓋反應物。然后進行95℃35 s變性，60℃35 s退火，70℃60 s延伸，共計30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。限制性酶切反應也在20μl體系中進行，其中包括PCR反應產物12μl，Cfol內切酶8U （10 U／μl），輕輕混勻后置于37℃消化過夜，消化產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳。 6.銀染：電泳后凝膠用蒸餾水沖