豬捷申病毒Swine-CH-IMH-03全長cDNA克隆的構(gòu)建及其3D蛋白的表達.pdf

1、目前，反向遺傳操技術(shù)是病毒基因工程疫苗、基因功能及致病機制研究等的一個有效工具，因此在病毒的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。為了構(gòu)建PTV感染性克隆，本試驗將PTV中國分離株Swine/CH/IMH/03全長基因組的4個相互重疊片段分別克隆到pBluscript SK(+)載體中，然后通過序列拼接，最終獲得了PTV全長基因組克隆(pSK-PTVFL)。測序證實，我們獲得的pSK-PTVFL中PTV-1基因組5’端為poly(C)，后接非翻譯區(qū)及

2、開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，3’端為poly(A)。除此之外，本試驗在PTV-1基因組5’端外引入了Kpn Ⅰ酶切位點，3’端外引入了Sac Ⅱ酶切位點，以便在體外轉(zhuǎn)錄時進行質(zhì)粒線性化。Kpn Ⅰ下游引入了T7啟動子，可以利用T7 RNA聚合酶進行體外轉(zhuǎn)錄合成RNA。概言之，我們獲得全長克隆為：Kpn Ⅰ-T7 promotor-PTV genome-Poly(A)-Sac Ⅱ。 和親本毒株Swi

3、ne/CH/IMH/03及其他PTV毒株序列比對發(fā)現(xiàn)，該克隆的5’-UTR和3’-UTR和PTV各毒株高度同源，其中與Talfan的同源性為100％，保證了5’-UTR和3’-UTR序列的完整和精確。該克隆的ORF區(qū)存在3個核苷酸及氨基酸位點突變，分別位于2A、2C和3D基因中，可以用作親本毒株與工程毒的鑒別。 同時，本試驗對PTV Swine/CI-UIMH/03 3’-UTR及5’-UTR進行了克隆、測序及序列比對，發(fā)現(xiàn)PT

4、V各毒株間的3’-UTR序列只有不到100個堿基，但極為保守，只有10個位點存在堿基替換。PTV Swine/CH/IMH/03的5’-UTR和其他PTV毒株高度同源，其中和Talfan毒株同源性為100％。 在上述構(gòu)建PTV-1全長cDNA克隆的基礎(chǔ)上，我們進行了PTV-1病毒挽救的工作，PTV-1病毒挽救進行了初步探討。 PTV-1全長cDNA克隆的成功構(gòu)建及我們積累的PTV-1挽救經(jīng)驗，為后期進行基于PTV反向遺傳

5、操作的病毒基因組結(jié)構(gòu)、功能及疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。 在PTV病毒中，3D蛋白是具有RNA依賴RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RDRP)活性蛋白，能介導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性的抗體。在同科的口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)中，以3D蛋白作為診斷抗原已經(jīng)建立了用于FMDV抗體檢測的診斷方法，而且得到了廣泛的應(yīng)用。為了能夠建立一種特異性的血清抗體檢測方法，

6、用于我國豬捷申病毒血清流行病學(xué)調(diào)查，本實驗以pSK-PTVFL為模板，通過PCR擴增了PTV 3D蛋白基因，并將其克隆到原核表達載體pET30a(+)，用IPTG對含重組質(zhì)粒的E.coli BL21重組菌進行了誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE結(jié)果表明，3D蛋白獲得了大量表達，薄層掃描表明表達的目的蛋白占菌體總蛋白的66.1％。Western blot顯示，表達的3D重組蛋白能被豬抗PTV的陽性血清識別，這為基于PTV 3D蛋白的快速ELISA