脫細胞同種異體肌腱復(fù)合人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2重建兔前交叉韌帶的實驗研究.pdf

1、一、研究目的：
　　 前交叉韌帶斷裂是常見的運動損傷，斷裂后只有進行替代物重建才能恢復(fù)關(guān)節(jié)的穩(wěn)定和功能。目前臨床上常用的韌帶替代物主要為自體韌帶(肌腱)、異體韌帶(肌腱)和人工材料移植物。上述三類重建材料都存在著諸多的弊端，無法成為臨床上理想的選擇。由于無供區(qū)的繼發(fā)損害，以及保存、取材技術(shù)的改進，目前同種異體肌腱在臨床上取得了廣泛的應(yīng)用。同種異體肌腱植入體內(nèi)，愈合過程類似于自體肌腱，需經(jīng)歷組織壞死、血管化、細胞爬行替代、重塑四個

2、階段。與自體肌腱不同，同種異體肌腱移植后，腱細胞表面的糖蛋白的MHC-1型抗原引起宿主的免疫排斥反應(yīng)，免疫反應(yīng)將影響異體肌腱與宿主骨的整合過程，可以導(dǎo)致腱-骨界面愈合延遲和減弱，甚至移植失敗。肌腱的細胞外基質(zhì)(ECM)主要由Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白組成，同種異體及異種個體之間的同一組織，其ECM得成分和結(jié)構(gòu)很相近，其自身的免疫原性低。脫細胞技術(shù)可以去除肌腱的免疫成分而保留細胞外成分原有的生物活性及力學特性。重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2具有很強的促進

3、成骨細胞分化和誘導(dǎo)體外成骨的能力，已有試驗發(fā)現(xiàn)可促進自體半腱肌重建ACL的腱骨愈合。本實驗使用磷酸三丁酯(TBP)進行脫細胞處理去除同種異體肌腱中的細胞成分，測定其對肌腱的組織學和力學特性的影響，脫細胞后的異體肌腱復(fù)合人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2重建兔交叉韌帶，定期對重建的ACL進行組織學觀察、影像學檢測及生物力學的檢測，了解脫細胞同種異體肌腱復(fù)合rh-BMP-2對ACL重建的影響。
　　 二、研究方法：
　　 (一)同種異

4、體肌腱的脫細胞處理
　　 取新西蘭兔的趾屈肌腱進行脫細胞處理，使用磷酸三丁酯(TBP)進行脫細胞。TBP法：1、低滲的10mmTris液(包括絲氨酸蛋白酶抑制劑+金屬蛋白酶抑制劑+青霉素/鏈霉素)保持36h；2、高滲鹽水+50mmTris液(包含1％辛基含苯氧基聚乙氧基乙醇+蛋白酶抑制劑)保持48h；3、Hank’s生理緩沖液進行漂洗；4、1％磷酸三丁酯36h+50mm三羥甲基氨基甲烷48h；5、含有抗生素的硫酸鹽緩沖液沖洗+浸

5、泡。
　　 (二)脫細胞肌腱的組織學和生物力學測定
　　 對脫細胞處理的異體肌腱進行HE染色、DAPI熒光染色檢測，觀察TBP脫細胞效果。使用二甲基亞甲藍(DMMB)法測定糖胺聚糖(GAG)含量，檢測脫細胞前后肌腱內(nèi)的GAG含量；使用動物組織基因組DNA小量提取試劑盒測定DNA含量，檢測脫細胞前后肌腱的DNA含量變化；使用羥脯氨酸試劑盒測定羥脯氨酸含量，根據(jù)羥脯氨酸占膠原蛋白的含量，計算膠原蛋白含量，觀察脫細胞前后膠原蛋

6、白的變化；檢測肌腱的最大張力負荷和彈性模量，了解脫細胞處理對肌腱生物力學的影響。
　　 (三)脫細胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建ACL的影像學觀察
　　 使用脫細胞肌腱重建兔前交叉韌帶，腱骨界面注入含rh-BMP-2的纖維蛋白凝膠，術(shù)后1、3、6月分別對患側(cè)膝關(guān)節(jié)骨隧道段進行CT平掃，在矢狀位測量膝關(guān)節(jié)股骨、脛骨隧道的入口段、出口段及中間段的寬度，并與對照組進行比較，了解脫細胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2對促進ACL重建后骨

7、隧道段的腱骨愈合的影像學變化。
　　 (四)脫細胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建ACL的組織學觀察和力學特性檢測
　　 使用脫細胞肌腱重建兔前交叉韌帶，腱骨界面注入含rh-BMP-2的纖維蛋白凝膠，術(shù)后1、3、6月分別對患側(cè)膝關(guān)節(jié)骨隧道段、重建的ACL進行硬組織切片、普通HE染色，觀察腱骨界面成骨情況及重建的ACL的炎癥反應(yīng)、細胞增殖等情況，并與對照組進行比較；使用生物材料測試機對術(shù)后3、6月的膝關(guān)節(jié)標本進行ACL抗拔出試

8、驗，記錄拔出的最大抗拉強度及彈性模量，了解脫細胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2對ACL重建后腱骨愈合的影響。
　　 三、結(jié)果：
　　 (一)脫細胞肌腱的組織學和生物力學測定
　　 經(jīng)磷酸三丁酯(TBP)脫細胞處理的肌腱，HE染色未見細胞成分染色，DAPI熒光染色未見陽性結(jié)果，提示細胞成分去除徹底；二甲基亞甲藍法測定糖胺聚糖含量，發(fā)現(xiàn)脫細胞前后對比無明顯差異；動物組織基因組DNA小量提取試劑盒測定DNA含量，發(fā)現(xiàn)脫細胞前

9、后肌腱內(nèi)DNA含量明顯減少；使用羥脯氨酸試劑盒間接測定膠原蛋白含量，發(fā)現(xiàn)脫細胞前后膠原含量無明顯差異；生物力學測試發(fā)現(xiàn)，脫細胞前后肌腱的最大張力負荷和彈性模量無明顯差異。
　　 (二)脫細胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建ACL的影像學觀察
　　 對ACL重建后的兔膝關(guān)節(jié)行CT平掃，可以較好地重建兔ACL重建模型的影像學情況。術(shù)后1月，兩組間骨隧道寬度對比無明顯差異；術(shù)后3月，脫細胞組骨隧道壁不光滑，存在成骨反應(yīng)，骨隧道寬度

10、與術(shù)后1月比較無明顯改變，而對照組未見成骨反應(yīng)，骨隧道寬度與術(shù)后1月相比，有增寬趨勢，但無統(tǒng)計學差異；術(shù)后6月，脫細胞組骨隧道壁成骨反應(yīng)較前增加，骨隧道寬度與術(shù)后1、3月略有增寬，但無統(tǒng)計學差異；而對照組仍無明顯成骨反應(yīng)，骨隧道寬度與術(shù)后1、3月相比，出現(xiàn)增寬現(xiàn)象，存在統(tǒng)計學差異。
　　 (四)脫細胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建ACL的組織學觀察和生物力學測試
　　 骨隧道段硬組織切片發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1月，脫細胞組腱骨間隙較小

11、，可見少量Sharpey纖維及軟骨細胞生成，而對照組腱骨間隙寬大，無Sharpey纖維及軟骨細胞生成；術(shù)后3月，脫細胞組腱骨間隙進一步減小，Sharpey纖維及軟骨細胞生成增多；而對照組腱骨間隙較前減小，少量Sharpey纖維及軟骨細胞生成；術(shù)后6月，脫細胞組腱骨間隙幾乎消失，Sharpey纖維大量生成排列有序，軟骨細胞成熟分化，而對照組腱骨間隙減小但存在，Sharpey纖維及軟骨細胞生成較前增多，但無明顯成熟分化趨勢。重建的ACL，術(shù)

12、后1月，脫細胞組可見少量淋巴細胞浸潤，而對照組存在大量淋巴細胞浸潤；術(shù)后3月，脫細胞組膠原纖維排列有序，可見成纖維細胞及軟骨細胞增生，而對照組膠原纖維松散，可見少量成纖維細胞，未見軟骨細胞；術(shù)后6月，脫細胞組軟骨細胞大量增生并出現(xiàn)成熟分化，膠原纖維排列緊密、有序，而對照組膠原結(jié)構(gòu)仍較松散，成纖維細胞及軟骨細胞數(shù)量較少。術(shù)后3、6月的生物力學測試，ACL重建的抗拔出試驗中，脫細胞組在彈性模量、最大載荷等指標均優(yōu)于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義

13、。
　　 四、結(jié)論：
　　 (一)、TBP法能有效去除同種異體肌腱內(nèi)部的細胞成分，去除免疫原性的同時對肌腱原有的生物學活性及力學特性無明顯影響。
　　 (二)、CT平掃能較好地重現(xiàn)膝關(guān)節(jié)重建ACL的影像。脫細胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建兔ACL后，CT平掃發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，術(shù)后3、6月未見骨隧道增寬跡象，腱-骨界面存在成骨反應(yīng)。
　　 (三)、脫細胞肌腱復(fù)合rh-BMP-2重建兔ACL后，與對照組相比