重組腺病毒介導(dǎo)人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4基因促進(jìn)兔腰椎后外側(cè)融合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：利用腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建人骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(hBMP-4)基因重組腺病毒并在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增制備重組病毒。將含hBMP-4基因的重組腺病毒液體，以直接體內(nèi)基因治療的方式研究其促進(jìn)兔腰椎后外側(cè)融合的作用。 方法：首先構(gòu)建攜帶BMP4基因的腺病毒重組質(zhì)粒pShuttleCMV.BMP4，PmeI酶切線性化后，與51ag黏粒pAdEasyl共轉(zhuǎn)染大腸桿菌BJ5183，收獲重組腺病毒黏粒pAd.BMP4。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pAd

2、.BMP4轉(zhuǎn)入HEK293，收取脫落的細(xì)胞并凍融，收集上清保存于4℃?zhèn)溆?；重?fù)4次，獲得第四代重組腺病毒液。以12只成年新西蘭白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，制備腰椎后外側(cè)融合模型，隨機(jī)分成兩組，實(shí)驗(yàn)組6只，對(duì)照組6只，實(shí)驗(yàn)組植入含病毒液體的膠原海綿；對(duì)照組僅為膠原海綿，不含病毒液體。術(shù)后分別于4、8周行X線觀察，12周行CT觀察并取材作組織學(xué)分析，觀察新骨形成情況。 結(jié)果：經(jīng)限制性酶切和PCR擴(kuò)增鑒定，證實(shí)為復(fù)制缺陷型BMP-4重組腺病毒，T

3、CID50法測(cè)定最終病毒滴度可達(dá)109pfu/ml。制備的重組腺病毒載體Ad-BMP-4以100的MOI值感染Hela細(xì)胞后，觀察7天，細(xì)胞未出現(xiàn)病態(tài)反應(yīng)，重組腺病毒體外轉(zhuǎn)染的安全性較高。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物植入病毒液體的部位無論從CT觀察、肉眼直接觀察、組織學(xué)分析，都清楚的顯示在該部位新的骨組織形成。新的骨組織聚集在椎板及相鄰上關(guān)節(jié)突周圍。而對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)新的骨組織形成，椎板表面光滑。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建了人骨形成蛋白4(hBMP-4)基因重組