自噬相關(guān)因子MAP1S介導(dǎo)TLR通路調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）是天然免疫中最重要的模式識(shí)別受體之一，它能夠識(shí)別并結(jié)合一系列具有相同病原相關(guān)分子模式（PAMPs）的病原體和內(nèi)源性的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)，啟動(dòng)機(jī)體的免疫應(yīng)答并激活炎癥反應(yīng)。Toll樣受體的識(shí)別范圍廣泛，既包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原體，還包含腫瘤抗原以及自身衰老和壞死細(xì)胞釋放的分子。Toll樣受體不僅表達(dá)于免疫細(xì)胞，也表達(dá)于腫瘤細(xì)胞。因此，Tol

2、l樣受體與宿主的感染、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等多種疾病存在交互關(guān)聯(lián)。但是截至目前為止，Toll樣受體在腫瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制仍然不是很清楚。
　　感染和腫瘤發(fā)生過程中常伴隨著Toll樣受體信號(hào)激活的細(xì)胞吞噬和自噬現(xiàn)象。目前，在嚴(yán)重感染和腫瘤的治療領(lǐng)域中，針對(duì)Toll樣受體的靶向治療引起了越來越多的關(guān)注。但是Toll樣受體信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和病原體吞噬的分子機(jī)制仍然不清楚，介導(dǎo)To l l樣受體信號(hào)通路的細(xì)胞自噬相關(guān)因子以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍亟待深

3、入探討。MAP1S是近年來新發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)因子，在各種組織中廣泛表達(dá)，并且對(duì)細(xì)胞自噬的發(fā)生和發(fā)展具有促進(jìn)作用。截至目前，關(guān)于 MAP1S介導(dǎo)Toll樣受體信號(hào)通路調(diào)控及其機(jī)制的研究仍未見報(bào)道。本研究以MAP1S為研究對(duì)象，從Toll樣受體信號(hào)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能和Toll樣受體信號(hào)通過介導(dǎo)自噬抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖與遷移兩個(gè)層面，分析了Toll樣受體信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞吞噬和自噬的分子機(jī)制，并探討了MAP1S在Toll樣受體信號(hào)串聯(lián)細(xì)胞吞噬和自

4、噬功能中的作用。
　　細(xì)胞吞噬和自噬的過程中Toll樣受體處于激活狀態(tài)，并引發(fā)炎癥反應(yīng)，提示三者之間存在著必然的聯(lián)系。本研究以MAP1S基因敲除鼠為研究模型，利用不同的Toll樣受體激活劑刺激小鼠原代巨噬細(xì)胞，比較了野生型和MAP1S缺失的巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的差異，發(fā)現(xiàn)MAP1S的缺失顯著地下調(diào)了TLR2配體LTA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-6的含量。在檢測(cè)TLR2信號(hào)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄激活因子活性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn) MAP1S的缺失抑制

5、了TLR2信號(hào)激活的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和轉(zhuǎn)錄激活因子 p38的活性。在野生型巨噬細(xì)胞中，MAP1S的表達(dá)響應(yīng)TLR2信號(hào)而顯著性上調(diào)，并且表現(xiàn)出對(duì)LTA誘導(dǎo)的時(shí)間依賴性。此外，表達(dá)上調(diào)的MAP1S通過激活細(xì)胞自噬，反饋抑制 Toll樣受體信號(hào)持續(xù)活化所致的炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果提示，MAP1S對(duì)巨噬細(xì)胞TLR2信號(hào)具有雙向調(diào)控作用，具體地說，MAP1S參與早期TLR2信號(hào)誘導(dǎo)細(xì)胞因子的表達(dá)，而反饋性抑制晚期TLR2信號(hào)持續(xù)激活所致的過強(qiáng)炎癥

6、反應(yīng)。研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MAP1S的缺失降低了巨噬細(xì)胞部分 TLRs的基礎(chǔ)表達(dá)，從而影響了巨噬細(xì)胞的細(xì)菌吞噬功能，而且巨噬細(xì)胞的細(xì)菌殺傷能力同樣由于MAP1S的缺失而顯著下調(diào)。
　　在腫瘤細(xì)胞的Toll樣受體信號(hào)與細(xì)胞自噬發(fā)生的關(guān)系研究中，鑒于前期研究結(jié)果提示，TLR5配體flagellin對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用，因此，我們首先利用全細(xì)胞MALDI-TOF質(zhì)譜確認(rèn)了flagellin對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7活性的抑制作

7、用，并證實(shí)了自噬相關(guān)因子 MAP1S在多種乳腺癌細(xì)胞中的普遍表達(dá)。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，MAP1S沉默的MCF-7細(xì)胞不響應(yīng)flagellin的抑制作用。經(jīng)flagellin處理的MCF-7細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯現(xiàn)象，細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)顯著下調(diào)，而周期依賴型激酶抑制因子p27的表達(dá)明顯上調(diào)，但MAP1S沉默的MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期沒有發(fā)生任何改變。由此證實(shí)，MAP1S可通過TLR信號(hào)通路調(diào)

8、控乳腺癌細(xì)胞的增殖，當(dāng)TLR受到特異性配體激活后，可通過MAP1S介導(dǎo)細(xì)胞增殖的調(diào)控信號(hào)通路。
　　考慮到 MAP1S具有調(diào)控細(xì)胞骨架網(wǎng)絡(luò)動(dòng)態(tài)穩(wěn)定的功能，本研究采用侵襲小室和細(xì)胞劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)了MAP1S是否影響經(jīng)flagellin處理的MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，flagellin能夠極大程度地抑制 MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移，但在MAP1S沉默的MCF-7細(xì)胞中，flagellin的抑癌作用受到了限制，提

9、示 MAP1S在 flagellin抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的過程中起著關(guān)鍵作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，MAP1S在flagellin誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子 IL-8和TNF-α的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。MAP1S也會(huì)響應(yīng) TLR5信號(hào)而表達(dá)上調(diào)，表達(dá)上調(diào)的MAP1S通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬反應(yīng)，反饋性地抑制腫瘤細(xì)胞中TLR5信號(hào)持續(xù)激活的炎癥反應(yīng)。
　　為了探討MAP1S在巨噬細(xì)胞Toll樣受體信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞吞噬和在乳腺癌細(xì)胞T

10、oll樣受體信號(hào)抑制腫瘤細(xì)胞增殖和遷移過程中的分子機(jī)制，本研究利用免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)巨噬細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和正常的人胚腎HEK293T細(xì)胞中Toll樣受體信號(hào)誘導(dǎo)自噬標(biāo)志分子LC3的LC3II/I蛋白比例以及LC3聚集體形成（自噬或吞噬功能增加的標(biāo)志）進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，只有MAP1S表達(dá)響應(yīng)的Toll樣受體信號(hào)才能誘導(dǎo)細(xì)胞中的LC3聚集體的形成和LC3II/I比例的增加，提示在MCF-7細(xì)胞中flagellin/TLR

11、5信號(hào)誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的自噬發(fā)生，在巨噬細(xì)胞中LTA或細(xì)菌/TLR2信號(hào)促進(jìn)了細(xì)胞的吞噬功能。
　　為獲得MAP1S介導(dǎo)TLR信號(hào)通路活化的調(diào)控位點(diǎn)，本研究進(jìn)一步分析了MAP1S與Toll樣受體接頭蛋白MyD88的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MAP1S與MyD88具有相互作用，并且MAP1S可以通過響應(yīng)Toll樣受體信號(hào)將MyD88轉(zhuǎn)運(yùn)至LC3II結(jié)合的自噬體或吞噬體，促進(jìn)自噬體/吞噬體的成熟。而響應(yīng)性上調(diào)表達(dá)的MAP1S可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生