胰島素對自噬相關(guān)基因GABARAPL1表達的影響及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的初步研究.pdf

1、目的：初步探討胰島素對自噬相關(guān)基因GABARAPL1表達的影響及胰島素對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制。
　　方法：建立梯度胰島素水平，處理人正常肝細胞（HL-7702）8小時，以單丹磺酰戊二胺(MDC)染色檢測HL-7702細胞自噬水平的變化，以Western Blotting技術(shù)檢測HL-7702細胞自噬相關(guān)基因GABARAPL1、Beclin1蛋白水平表達的變化;構(gòu)建含有 GABARAPL1啟動子序列的熒光素酶報告基因融合載體，并在此基礎(chǔ)

2、上，采取截除突變失活和直接點突變失活各個胰島素反應(yīng)位點，構(gòu)建截除突變型及點突變型 GABARAPL1啟動子熒光素酶報告基因融合載體；將構(gòu)建好的含有GABARAPL1啟動子序列的融合載體轉(zhuǎn)染至 HL-7702細胞，24小時后以Luciferase Assay檢測其基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性的變化，初步明確胰島素對GABARAPL1表達調(diào)控的識別模序。
　　結(jié)果：
　　1、與對照組相比，1nM、10nM、100nM胰島素處理組HL-7702細

3、胞的自噬活性均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01），且在0nM-100nM的范圍內(nèi)呈現(xiàn)出一定程度的量效關(guān)系。
　　2、與0nM胰島素處理組相比，1nM、10nM、100nM胰島素處理組HL-7702細胞自噬相關(guān)基因GABARAPL1、Beclin1的蛋白表達均有所下降，以100nM胰島素處理組下降最為顯著（p<0.01），且在0nM-100nM的范圍內(nèi)亦顯示出一定程度的量效關(guān)系。
　　3、失活GABARAPL1近啟動子區(qū)域

4、內(nèi)的IRE1、IRE2或IRE3位點，GABARAPL1啟動子的轉(zhuǎn)錄活性下降，且在失活I(lǐng)RE1、IRE2位點較為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.01）。
　　4、與對照組相比，1nM、10nM、100nM胰島素處理組 GABARAPL1啟動子的活性均降低，且以100nM胰島素處理組最為顯著（p<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1、胰島素抑制自噬相關(guān)基因GABARAPL1的蛋白表達及基因轉(zhuǎn)錄。
　　2、GABARAP