胰島素對2型糖尿病大鼠下頜骨組織蛋白表達的影響及相關機制的初步研究.pdf

1、人工種植技術已經(jīng)被廣泛地應用到牙齒缺失、頜骨缺損等多個方面，成為一種成熟可靠的修復方法。但對于糖尿病患者的人工種植體存在風險，臨床調(diào)查研究顯示，糖尿病患者的種植1年成功率約為84.3-90％，要明顯低于非糖尿病患者的95%。
　　糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，分為1型和2型，糖尿病患者中有90%為2型糖尿病，并且其發(fā)病率逐年升高。研究已證實，2型糖尿病會導致人或者動物模型的骨組織鈣磷流失，骨代謝異常，以及骨結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量發(fā)

2、生改變。種植體骨整合是人工種植體修復成功的基礎，而2型糖尿病導致種植體周圍骨形成減少、骨愈合不良以及組織愈合延遲。動物實驗同樣證實糖尿病大鼠種植體周圍骨形成障礙，骨形成過程中的關鍵因子低于正?；钚员憩F(xiàn)。
　　骨形成是一個復雜的過程，成骨發(fā)生的關鍵是骨髓基質(zhì)細胞向骨形成轉(zhuǎn)變，分化為成骨細胞，繼而成骨細胞分化，完成細胞外基質(zhì)的合成、沉積和礦化。研究證實，高糖環(huán)境下骨髓基質(zhì)細胞成骨分化能力減弱，成骨細胞的增殖和礦化能力也減弱，這些都被認

3、為是糖尿病導致骨質(zhì)下降的原因，但其機制尚不清楚。
　　胰島素是一種重要的細胞代謝調(diào)節(jié)激素，是目前控制血糖的有效藥物。胰島素能促進細胞的生長和分化，尤其是對骨代謝相關細胞的作用受到廣泛關注。研究證實，胰島素可通過直接或間接作用促進成骨合成，預防骨流失，從而提高骨密度和骨強度，因此，胰島素的應用可以改善2型糖尿病對骨質(zhì)的影響，但其影響機制尚不清楚。
　　蛋白質(zhì)組學已經(jīng)廣泛應用于研究某種疾病全蛋白的定性和定量表達，被視為一種強大的

4、研究疾病相關蛋白的方法，其可為不同的細胞、組織和生物過程提供參考圖和數(shù)據(jù)庫。蛋白質(zhì)組學已經(jīng)應用于糖尿病及骨組織的研究，但迄今為止，對于胰島素及2型糖尿病對下頜骨中全蛋白的影響未見報道，應用蛋白質(zhì)組學研究有助于探討2型糖尿病對頜骨的影響機制，以及胰島素改善2型糖尿病對頜骨影響的機制。
　　第一部分胰島素對2型糖尿病大鼠下頜骨組織蛋白表達的蛋白質(zhì)組學研究
　　目的：探討2型糖尿病大鼠與正常大鼠下頜骨組織表達的蛋白差異以及胰島素對

5、差異蛋白的影響。內(nèi)容：對正常大鼠（Wistar大鼠）、2型糖尿病大鼠（Goto-Kakizaki大鼠）以及給予胰島素（Insulin）治療2周的糖尿病大鼠的下頜骨組織進行蛋白質(zhì)組學分析。根據(jù)結(jié)果篩選出受胰島素調(diào)控的蛋白，進一步應用Q-PCR檢測受調(diào)控蛋白的mRNA在正常大鼠、糖尿病大鼠、以及胰島素分別治療2周和4周的糖尿病大鼠下頜骨組織中的表達。結(jié)果：經(jīng)過雙向凝膠電泳及MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，成功鑒定Wistar大鼠和GK大

6、鼠下頜骨組織間差異顯著的蛋白點36個，主要分屬于6大功能：代謝、蛋白結(jié)合、細胞支架、細胞外基質(zhì)蛋白、信號轉(zhuǎn)導、免疫應答。其中10個蛋白的表達顯著受胰島素的調(diào)控。Q-PCR結(jié)果顯示，胰島素可改善10個差異蛋白mRNA在GK大鼠頜骨組織中的表達，且給予4周胰島素治療的作用顯著。結(jié)論：蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠同正常大鼠下頜骨表達的差異蛋白，可作為研究2型糖尿病對頜骨代謝影響的新靶點。
　　第二部分胰島素對高糖環(huán)境下prohibiti

7、n和peroxiredoxin-6在大鼠頜骨骨髓基質(zhì)細胞成骨分化過程中表達的影響
　　目的：探討高糖環(huán)境下prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在大鼠頜骨骨髓基質(zhì)細胞成骨分化過程中的表達及胰島素對其表達的影響。方法：從Wistar大鼠下頜骨中分離培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞。MTT法檢測在不同葡萄糖濃度(5.5、25、45mM)及不同胰島素濃度（0，10-7，10-6和10-5M）培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞1、3、5、7、10d，細胞

8、的增殖情況；將細胞分別于不同糖濃度下（5.5、25、45mM）及胰島素(0、10-5mol/L)的干預下成骨誘導。礦化21d，茜素紅染色，礦化定量分析，觀察對細胞礦化的影響。礦化誘導1、3、7、14、21d，ELISA試劑盒檢測prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白的表達。結(jié)果：①與5.5mM糖濃度相比，25mM高糖環(huán)境中rBMSC的增殖活性增強，45mM高糖環(huán)境中rBMSC的增殖活性顯著下降；②10-5M胰島素可顯著

9、提高rBMSC在三種糖濃度中的增殖活性；③與5.5mM糖濃度相比，25mM組可見少量散在的礦化基質(zhì)，但45mM組未見明顯的礦化結(jié)節(jié)，胰島素可改善高糖環(huán)境下rBMSC鈣結(jié)節(jié)的形成；④高糖環(huán)境下，prohibitin和peroxiredoxin-6在rBMSC成骨分化表達下降，45mM組蛋白下降尤為顯著，10-5M胰島素可上調(diào)高糖環(huán)境中prohibitin和peroxiredoxin-6的表達；⑤Prohibitin蛋白在rBMSC成骨分化

10、的第3d表達顯著，peroxiredoxin-6蛋白則在rBMSC成骨分化第21d表達顯著。結(jié)論：高糖環(huán)境抑制rBMSC的增殖和礦化，胰島素可改善這種抑制作用。Prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白分別在rBMSC成骨分化早期和后期起到重要作用。高糖環(huán)境對prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在rBMSC成骨分化過程中的表達有抑制作用，胰島素可改善高糖的抑制作用。
　　第三部分胰島素對高糖環(huán)境下

11、prohibitin和peroxiredoxin-6在大鼠成骨細胞（ROS17/2.8）分化過程中表達的影響
　　目的：探討高糖環(huán)境下prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白在大鼠成骨細胞分化過程中的表達變化及胰島素對其表達的影響。方法：將大鼠成骨細胞（ROS17/2.8）在不同葡萄糖濃度(5.5、25、45mM)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入不同濃度胰島素（0，10-7，10-6和10-5M）培養(yǎng)1、3、5、7、10d，M

12、TT法檢測細胞增殖；將細胞分別于不同糖濃度下（5.5、25、45mM）及胰島素(0、10-6mol/L)的干預下培養(yǎng)1、3、7、14、21d，ELISA試劑盒檢測prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白的表達。礦化21d，茜素紅染色，礦化定量分析，觀察對細胞礦化的影響。結(jié)果：①與5.5mM糖濃度相比，25mM高糖環(huán)境中大鼠成骨細胞的增殖活性增強，45mM高糖環(huán)境中細胞增殖活性顯著下降；②10-6M胰島素可顯著提高成骨細胞

13、在三種糖濃度中的增殖活性；③與5.5mM糖濃度相比，25mM組鈣結(jié)節(jié)較少，45mM組未見明顯的礦化結(jié)節(jié)，胰島素可改善細胞礦化情況；④高糖環(huán)境下prohibitin和peroxiredoxin-6在大鼠成骨細胞中的表達下降，45mM組蛋白下降更為顯著，10-6M胰島素可上調(diào)高糖環(huán)境中prohibitin和peroxiredoxin-6的表達；⑤Prohibitin和peroxiredoxin-6蛋白均在成骨細胞分化第21d表達顯著，均在第