DENV-2對(duì)原代HHSECs凋亡,自噬及其相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：研究Ⅱ型登革病毒（DENV-2）感染原代人肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（HHSEC）后，HHSECs的凋亡、自噬情況，以及ICAM-1和Beclin-1 mRNA水平的，并分析它們?cè)诘歉锊《局虏∵^(guò)程中可能的機(jī)制。
　　方法：通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜表面CD31分子；免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞漿Ⅷ因子的表達(dá)，以鑒定HHSECs。RT-PCR擴(kuò)增DENV-2 NS1基因部分序列，鑒定病毒；根據(jù)NS1的序列設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，HindⅢ酶切，預(yù)期酶切片段大小為

2、228bp和185bp，對(duì)病毒進(jìn)一步鑒定；測(cè)定DENV-2對(duì)C6/36細(xì)胞的TCID50。以105TCID50的DENV-2作用于HHSECs，實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)態(tài)檢測(cè)DENV-2 NS1部分序列，以觀察HHSECs受DENV-2感染的情況；CCK8法動(dòng)態(tài)觀察受感染細(xì)胞的損傷情況并計(jì)算其抑制率。實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)態(tài)檢測(cè)被DENV-2感染的HHSECs的ICAM-1及Beclin-1（自噬相關(guān)基因）mRNA水平的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)被

3、DENV-2感染后的HHSECs細(xì)胞凋亡率，LC3B（自噬相關(guān)蛋白）以及ICAM-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：細(xì)胞呈梭形，生長(zhǎng)良好，輪廓清晰，“鵝卵石”樣排列；免疫組化法檢測(cè)HHSECsⅧ因子的表達(dá)，DAB染色后與空白對(duì)照對(duì)比，可見(jiàn)細(xì)胞漿含棕黃色的顆粒；流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD31表達(dá)率87.1％，符合HHSECs的特點(diǎn)。RT-PCR擴(kuò)增DENV-2 NS1基因部分序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，長(zhǎng)度在400bp左右，與預(yù)期長(zhǎng)度413b

4、p一致，證實(shí)為DENV-2 NS1部分基因序列；HindⅢ酶切得到兩條酶切片段，長(zhǎng)度在200bp左右，和預(yù)期一致；DENV-2毒株對(duì)C6/36細(xì)胞的TCID50為10-6.845/ml。Real time PCR檢測(cè)HHSECs中NS1基因mRNA的表達(dá)：未感染組不表達(dá)NS1基因；DENV-2作用于HHSECs后，表達(dá)DEN V-2 NS1 mRNA，DENV-2可感染HHSECs并在其中增殖，且于36h達(dá)峰值，以12h為對(duì)照，計(jì)算2-

5、△△Ct值為11.33±1.77（P<0.05）。病毒作用細(xì)胞后，CCK8法檢測(cè)DENV-2對(duì)細(xì)胞的毒性作用，細(xì)胞與未感染組有差別，不同時(shí)間點(diǎn)抑制率分別為10.9%±1.24%（12h），16.4%±0.42%（24h），17.0%±0.46%（36h），29.6%±0.26（48h）。流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)觀察被DENV-2感染的HHSEC凋亡情況，12h的凋亡率為13.17%，最為明顯；之后逐漸減少，24h、36h和48h分別為4.31%，

6、3.909%和2.975%。流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)被DENV-2感染的HHSECs，其LC3B的表達(dá)于36h達(dá)到峰值，表達(dá)率為35.5%；12h，24h和48h LC3B的表達(dá)率，分別為17.0%，22.3%和20.8%。流式細(xì)胞術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)被 DENV-2感染的HHSECs表面ICAM-1表達(dá)，12h，24h，36h和48h分別為9.17%，14.7%，12.7%，11.6%。Real time PCR檢測(cè)HHSECs中相關(guān)基因mRNA的表

7、達(dá)水平：Beclin1及 ICAM-1 mRNA在24h達(dá)峰值，以未感染組為對(duì)照，2-△△Ct值分別為46.77±2.55和40.97±4.91，爾后逐漸下降。
　　結(jié)論：HHSEC對(duì)DENV-2易感；且DENV-2對(duì)HHSECs生長(zhǎng)有抑制作用；并可誘導(dǎo)ICAM-1上調(diào)，激活HHSECs。這或許可以成為探究登革病毒致病機(jī)制的新模型。HHSEC被DENV-2感染后，LC3B及Beclin1的表達(dá)增高；DENV-2感染早期可誘導(dǎo)HHS