沙門菌質(zhì)粒毒力基因spv對DCs自噬、凋亡和免疫調(diào)節(jié)功能的影響.pdf

1、目的：通過細胞模型和實驗動物模型，研究沙門菌毒力基因(Salmonella plasmid virulence genes，spv)對樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)自噬、凋亡和免疫調(diào)節(jié)功能的影響及其分子機制，探索通過調(diào)控細胞自噬和凋亡水平增強機體免疫功能以控制感染進程的新途徑，并為后續(xù)新藥靶位的發(fā)現(xiàn)提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：⑴細胞模型的體外實驗。以攜帶spv基因的傷寒沙門菌(Salmonella t

2、yphi，ST)ST8為研究對象，用含spv基因的鼠傷寒沙門菌標準毒株SR-11作為陽性對照、不攜帶spv基因的傷寒沙門菌ST10作為陰性對照，將細菌與小鼠骨髓來源的DCs(bone marrow-derived DCs，BMDCs)共培養(yǎng)；同時用不加細菌的正常細胞作對照組；另設自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin，RAPA)干預組，即將細胞預先用含RAPA的培養(yǎng)基過夜處理后分別與上述三種細菌共培養(yǎng)。分別于不同時間段收獲細胞，用Wes

3、tern blot法檢測BMDCs自噬蛋白Beclin-1的表達，比色法測定其Caspase-3的活性，流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析BMDCs的凋亡率、吞噬能力以及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達，混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction，MLR)檢測BMDCs刺激CD4+和CD8+初始型T(naive T)細胞增殖的能力，ELISA法測定培養(yǎng)液上清中IL-12、IF

4、N-γ、IL-10和IL-4等細胞因子的水平，臺盼藍染色法進行活細胞計數(shù)，平板菌落計數(shù)法檢測BMDCs內(nèi)活菌數(shù)。⑵小鼠模型的體內(nèi)實驗。由于傷寒沙門菌是一種嚴格只對人類致病的病原體，沒有合適的動物模型和有效的遺傳學工具，本實驗利用與其有非常近緣關系的鼠傷寒沙門菌建立動物感染模型，用鼠傷寒沙門菌標準毒株SR-11和不攜帶spv基因的低毒株BRD509經(jīng)腹腔注射感染小鼠；同時以未感染細菌的小鼠作為正常對照組；另設RAPA干預組，即在感染模型建

5、立后每天經(jīng)腹腔注射適量RAPA。分別在不同時間段觀察小鼠一般狀態(tài)，處死小鼠后比較肝臟和脾臟的病理變化，免疫組化法檢測肝臟和脾臟Beclin-1和Caspase-3蛋白的表達，F(xiàn)CM分析脾臟DCs的凋亡率、吞噬能力及表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達，MLR檢測脾臟DCs刺激naive T細胞增殖的能力，ELISA法測定血清中IL-12、IFN-γ、IL-10和IL-4等細胞因子的水平，平板菌落計數(shù)法檢測小鼠肝臟和脾臟的活菌

6、數(shù)。
　　 結(jié)果：①用RAPA干預前，細菌與BMDCs共作用后2 h，ST10組的Beclin-1表達量高于SR-11組和ST8組，RAPA干預后0 h即可出現(xiàn)此差異；體內(nèi)實驗顯示細菌感染早期，BRD509組小鼠臟器的Beclin-1表達高于SR-11組。用RAPA干預后體內(nèi)外各組Beclin-1的表達均升高。②用RAPA干預前，體內(nèi)外各組DCs的凋亡率和Caspase-3活性均隨感染時間的延長逐漸升高。體外實驗SR-11組和S

7、T8組高于ST10組，用RAPA干預后，SR-11組和ST8組下降，而ST10組上升；體內(nèi)小鼠脾臟DCs的凋亡率和Caspase-3活性表現(xiàn)為SR-11組高于BRD509組，用藥后SR-11組降低，而BRD509組升高。③用RAPA干預前，隨感染時間的延長，體內(nèi)外實驗各組DCs的吞噬能力均不斷下降。體外實驗ST10組的吞噬率低于SR-11組和ST8組；體內(nèi)實驗BRD509組的吞噬率低于SR-11組。用RAPA干預后，體內(nèi)外各組DCs的吞

8、噬率均明顯下降。④用RAPA干預前，體內(nèi)外各組DCs表面共刺激分子CD40、CD80和CD86的表達均隨感染時間的延長逐漸升高，刺激naive T細胞增殖的能力也不斷增強。體外實驗顯示ST10組明顯強于SR-11組和ST8組；體內(nèi)實驗BRD509組明顯強于SR-11組。用RAPA干預后，體內(nèi)外各組DCs共刺激分子的表達均上升，naive T細胞的增殖程度亦升高。⑤用RAPA干預前，體內(nèi)外各組IL-12和IFN-γ水平隨著時間延長顯著升高

9、。體外表現(xiàn)為ST10組明顯高于SR-11組和ST8組；體內(nèi)實驗BRD509組明顯高于SR-11組。用RAPA干預后，體內(nèi)外各組IL-12和IFN-γ的水平均上升。⑥用RAPA干預前，體內(nèi)外各組在細菌感染早期均未檢測到IL-10。體外感染后期SR-11組和ST8組BMDCs分泌的IL-10大量增加，明顯高于ST10組；體內(nèi)感染后期SR-11組的IL-10有表達，而BRD509則仍檢測不到。用RAPA干預后，體內(nèi)外各組IL-10的表達水平均

10、低于用藥前。不管RAPA干預與否，各組均未檢測到IL-4的表達。⑦用RAPA干預前，體外實驗SR-11組和ST8組BMDCs的存活率低于ST10組，而胞內(nèi)活菌數(shù)則SR-11組和ST8組高于ST10；體內(nèi)感染后期，SR-11組小鼠的一般狀態(tài)較BRD509組差，臟器病理變化嚴重，活菌數(shù)亦較高。用RAPA干預后，體外實驗SR-11組和ST8組BMDCs的存活率升高，而ST10組降低，胞內(nèi)活菌數(shù)表現(xiàn)為SR-11組和ST8組降低，而ST10組升高

11、；體內(nèi)實驗SR-11組臟器內(nèi)活菌數(shù)降低而BRD509組升高，SR-11組臟器較用藥前損傷減輕而BRD509組加重。
　　 結(jié)論：⑴攜帶spv基因的沙門菌由于毒力較強，可通過抑制自噬，促進凋亡而加重感染，用RAPA干預其體內(nèi)外感染模型后自噬被適度激活可對細胞和機體起到一定的保護作用；而無spv基因的沙門菌可通過適度激活自噬以減少細菌對細胞和機體的損害，對自身起到保護作用，當自噬被RAPA過度增強后，反而導致宿主的損傷。⑵攜帶spv