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文檔簡介
1、目的:阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)可導(dǎo)致或加重認(rèn)知功能障礙,其機(jī)制與間歇低氧(IH)所致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們前期研究已證實間歇低氧可以誘導(dǎo)自噬激活并加重了海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡。然而,間歇低氧是如何誘導(dǎo)海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬激活并加重凋亡的,其具體機(jī)制仍不清楚。低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)是由對氧敏感的α亞基和結(jié)構(gòu)亞基β亞基組成,在低氧、缺血/再灌注等處理后其表達(dá)均明顯增加并可以介導(dǎo)細(xì)胞自噬激活。此外,HIF-1α的下游靶蛋白
2、 BNIP3與自噬相關(guān)蛋白 Beclin1的表達(dá)也密切相關(guān)。因此,我們推測HIF-1α可能介導(dǎo)了間歇低氧致海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡中自噬的變化。本研究通過間歇低氧處理海馬神經(jīng)細(xì)胞建立OSAHS模型,應(yīng)用藥物干預(yù)HIF-1α表達(dá)及多種分子生物學(xué)檢測技術(shù),檢測各組海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬強度和HIF-1α-BNIP3-Beclin1信號通路及細(xì)胞凋亡的變化,研究間歇低氧是否通過 HIF-1α-BNIP3-Beclin1信號通路介導(dǎo)了海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬激活并促
3、進(jìn)了細(xì)胞凋亡。
方法:①研究對象:取新生SD乳鼠(出生24h內(nèi)),剝離出海馬組織,制備細(xì)胞懸液,接種并行原代海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng),普通光學(xué)顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元的生長情況。②模型建立與分組:建立不同時間段的間歇低氧細(xì)胞模型,設(shè)正常對照組(NC)、間歇低氧4h、8h、12h組。IH組循環(huán)給予常氧21%O2持續(xù)10min,低氧1.5%O2持續(xù)5min,分別處理4h、8h和12h,NC組持續(xù)給予21%濃度的常氧。③藥物干預(yù)與分組:給予Y
4、C-1干預(yù)HIF-1α表達(dá),設(shè)正常對照組、IH組、YC-1干預(yù)組、IH+YC-1干預(yù)組。選取HIF-1α及自噬表達(dá)變化最明顯的間歇低氧時間點12h進(jìn)行處理,YC-1預(yù)處理方法:YC-1稀釋液在間歇低氧或常氧前預(yù)處理2h。④檢測指標(biāo):通過免疫熒光染色檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞膜標(biāo)記蛋白MAP-2的表達(dá);通過 western blot技術(shù)和免疫熒光技術(shù)檢測各組海馬神經(jīng)細(xì)胞LC3-II和cleaved-caspase-3以及HIF-1α-BNIP3-B
5、eclin1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,TUNEL法檢測各實驗組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。
結(jié)果:①海馬神經(jīng)細(xì)胞的生長狀態(tài)觀察:光學(xué)顯微鏡下觀察到成熟的海馬神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)出聚集生長趨勢,神經(jīng)元的軸突和樹突增粗并相互交織形成網(wǎng)狀,且免疫熒光顯示海馬神經(jīng)細(xì)胞特異性表達(dá)MAP-2。②間歇低氧對海馬神經(jīng)元HIF-1α和LC3-II蛋白表達(dá)的影響:western blot法檢測結(jié)果顯示,IH組HIF-1α和LC3-II蛋白表達(dá)均明顯增多,兩種蛋
6、白表達(dá)均與間歇低氧時間有關(guān),間歇低氧12h表達(dá)最多,與NC組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);免疫熒光染色檢查顯示間歇低氧處理后分別代表 HIF-1α、LC3-II綠色熒光增加(P<0.05)③干預(yù)HIF-1α表達(dá)對海馬神經(jīng)元的自噬水平影響:western blot檢測結(jié)果顯示,與NC組相比IH組LC3-II蛋白表達(dá)顯著增多,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);YC-1+IH組LC3-II表達(dá)較IH組明顯減少(P<0.05)。免
7、疫熒光檢測結(jié)果顯示,與對照組相比IH組代表LC3-II的綠色熒光點數(shù)顯著增多(P<0.05);YC-1+IH組綠色熒光點數(shù)較 IH組明顯減少,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);④干預(yù) HIF-1α表達(dá)對原代海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響:western blot技術(shù)檢測結(jié)果顯示,IH組cleaved caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多,并與間歇低氧時間有關(guān),間歇低氧12h表達(dá)最多,與 NC組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0.05);YC-1
8、+IH組cleaved-caspase3蛋白表達(dá)較IH組明顯減少(P<0.05);TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測結(jié)果也顯示,間歇低氧處理后細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)增加(P<0.05), YC-1+IH組細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞數(shù)較 IH組明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。⑤干預(yù)HIF-1α表達(dá)對海馬神經(jīng)細(xì)胞HIF-1α-BNIP3-Beclin1通路蛋白及自噬標(biāo)記蛋白 LC3-II表達(dá)的影響:western blot技術(shù)檢測結(jié)果顯示,I
9、H組HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3-II蛋白表達(dá)明顯增高,且隨著間歇低氧時間的增加,蛋白表達(dá)也逐漸增多 IH12h表達(dá)最多,與正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);YC-1+IH組HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3-II蛋白表達(dá)較IH組明顯減少,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);YC-1單獨給藥組HIF-1α、BNIP3、Beclin1和LC3-II蛋白表達(dá)與對照組無顯著差異。
10、結(jié)論:本研究證實:①間歇低氧處理后海馬神經(jīng)細(xì)胞自噬激活伴隨著HIF-1α高表達(dá);②間歇低氧狀態(tài)下抑制HIF-1α的表達(dá)后自噬標(biāo)記蛋白LC3-II表達(dá)也降低;③間歇低氧狀態(tài)下海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡蛋白 cleaved-caspase3表達(dá)增加,抑制HIF-1α的表達(dá)后 cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯減少。④間歇低氧狀態(tài)下HIF-1α-BNIP3-Beclin1信號通路蛋白表達(dá)均增加,抑制 HIF-1α的表達(dá)后HIF-1α-BNIP
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