大黃素聯(lián)合KGF與HIF-1α在低氧細胞應(yīng)激損傷中的自噬機制研究.pdf

1、目的：采用傳統(tǒng)中藥提取物結(jié)合基因治療的策略，用于保護低氧環(huán)境下?lián)p傷的腸粘膜，改善腸粘膜屏障的結(jié)構(gòu)和功能。本實驗以大鼠小腸隱窩上皮細胞（IEC-6）為體外模型，使用大黃素聯(lián)合低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α）和角質(zhì)細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF），建立新的治療方案，明確其在低氧所致腸應(yīng)激損傷中通過細胞自噬機制起保護作用。
　　方法：1.

2、通過MTT法篩選大黃素最佳作用濃度；2.用攜帶GFP熒光蛋白基因的腺病毒轉(zhuǎn)染IEC-6細胞，測定最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)（multiplicityofy infection，MOI）；3.分為四組：對照組，細胞因子組（攜帶雙基因HIF-1α和KGF組），大黃素組，大黃素聯(lián)合細胞因子組（攜帶雙基因HIF-1α和KGF聯(lián)合大黃素組），各組分別作用相應(yīng)藥物；4.在低氧0小時、6小時、24小時分別MTT法檢測細胞生存率、流式細胞儀檢測細胞周期；5.在低氧6

3、小時、24小時分別行透射電鏡觀察自噬體的出現(xiàn)、Real time-PCR檢測自噬相關(guān)基因（Beclin-1、LC3）、Western-blot法檢測自噬相關(guān)蛋白（Beclin-1、LC3）；6.攜帶HIF-1α和KGF兩種基因的腺病毒轉(zhuǎn)染IEC-6細胞，用Real time-PCR法、免疫熒光法、Western-blot蛋白印記法檢測細胞因子組和大黃素聯(lián)合細胞因子組在低氧0小時、6小時、24小時兩種外源基因（HIF-1α、KGF）的表達

4、。
　　結(jié)果：1.大黃素在濃度為5μmol/L時具有明顯促進細胞生長作用；2.根據(jù)攜帶GFP熒光蛋白基因的腺病毒轉(zhuǎn)染IEC-6檢測熒光表達率與相應(yīng)MTT實驗可得到腺病毒的最佳MOI為100；攜帶HIF-1α和KGF的腺病毒按照最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染IEC-6；3.MTT法可得出在低氧條件下，大黃素聯(lián)合細胞因子組對IEC-6細胞有較好的保護作用，細胞周期結(jié)果顯示細胞因子可明顯阻滯細胞在G1期（P<0.01），大黃素可明顯促進細胞進入分裂期

5、（P<0.01），大黃素聯(lián)合細胞因子組可促進細胞進入S期（P<0.01），因此，大黃素促進細胞進入分裂期作用大于細胞因子阻滯細胞作用，大黃素聯(lián)合細胞因子組有明顯的促細胞生長作用。4.電鏡下可見低氧6小時、24小時各組細胞均可見自噬小體出現(xiàn)；Real time-PCR檢測與常氧對照組相比，低氧6小時、24小時后自噬相關(guān)基因Beclin-1及LC3表達量均上調(diào)（P<0.01），其中自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3在低氧6小時的表達較24

6、小時基因表達明顯增多（P<0.05），且大黃素聯(lián)合細胞因子組較大黃素組、細胞因子組及對照組組表達增多（P<0.05）；Western-blot結(jié)果提示低氧6、24小時后，Beclin-1與LC3蛋白均有表達，大黃素聯(lián)合細胞因子組較大黃素組、細胞因子組及對照組表達增多（P<0.05）。5.Real time-PCR法及免疫熒光法檢測HIF-1α及KGF兩種外源基因在低氧0、6、24小時在IEC-6細胞內(nèi)均穩(wěn)定表達；Western-blot

7、結(jié)果提示腺病毒攜帶的基因在轉(zhuǎn)入細胞后HIF-1α蛋白穩(wěn)定表達，在常氧對照組及低氧各組表達中無明顯差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：1.大黃素聯(lián)合細胞因子在低氧條件下，可通過增強細胞的自噬機制對細胞起保護作用。2.大黃素聯(lián)合細胞因子（HIF-1α和KGF）較單用大黃素或細胞因子促進自噬相關(guān)基因的激活及蛋白的表達作用更為明顯。3.攜帶兩種基因的腺病毒可穩(wěn)定安全的將HIF-1α和KGF外源基因轉(zhuǎn)染入細胞內(nèi)部，并且在核酸水平及蛋白水平穩(wěn)定