影響PD鼠腦病理改變的基因篩選及表達的研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是中老年常見的中樞神經系統(tǒng)(CNS)退行性疾病，多巴胺(Dopamine，DA)能神經細胞移植是治療PD的有效手段之一，恰當并且充足的細胞供體源則是成功施行腦細胞移植治療PD的關鍵。神經干細胞(Neuralstemcells，NSCs)作為具有多重分化潛能和自我更新能力的高度未分化細胞，被視為腦細胞移植治療腦疾病的理想供體細胞。但NSCs的分化非常復雜，正常情況下，其分化為DA神經元

2、的比例不超過0.01％。因此，在細胞移植前必須先誘導NSCs定向分化為DA神經元，才能有效糾正PD的癥狀。 研究發(fā)現，NSCs的分化受到分化微環(huán)境中多種因素的影響。目前，已被證實具有促使NSCs向DA神經元定向分化作用的因子包括：IL-α，IL-11，白血病抑制因子(Leukemiainhibitoryfactor，LIF)以及膠質細胞源性神經營養(yǎng)因子(Glialcell-derivednetlrotrophicfactor，G

3、DNF)。Storch等發(fā)現在上述細胞因子混合液的基礎上加入紋狀體細胞分泌液，人類中腦來源NSCs分化為TH陽性多巴胺能神經元的比例驟升了近6倍，分化細胞具有成熟DA神經元形態(tài)。Hitoo等發(fā)現，將NSCs移植到以6-羥基多巴胺(6-OHDA)毀損制作的PD模型鼠紋狀體內后，DA神經元會更多，細胞更大，突起更長，他們用抗體阻斷技術證實，在毀損側紋狀體內GDNF和bFGF的分泌增加，有促DA神經元分化作用。這些研究提示，在紋狀體內存在著誘

4、導NSCs向DA神經元定向分化的因子，而以6-OHDA毀損黑質-紋狀體通路后，紋狀體內這些因子的含量顯著增強，或者分泌了新的因子。 因此本課題擬通過立體定向方法紋狀體內注射6-OHDA制備單側PD模型，利用抑制性消減雜交(Suppressionsubtractivehybridization，SSH)，比較健側與毀損側紋狀體細胞之間mRNA的表達差異，分析在6-OHDA毀損后，紋狀體分泌因子的變化，構建差異cDNA文庫，選取相關

5、基因，研究其對神經干細胞增殖、分化的影響。 在第一部分實驗中采用立體定向方法紋狀體內注射6-OHDA制備PD模型，通過行為學以及高效液相色譜電化學方法進行檢測，以期建立PD實驗研究所需的穩(wěn)定、可靠的理想模型，為在PD中進一步觀察影響黑質紋狀體病理變化的基因篩選及其表達的研究提供實驗平臺。實驗結果如下： 1.立體定向紋狀體內注射6-OHDA制備的PD模型，其行為學改變呈漸進性過程。于術后兩周大鼠出現緩慢旋轉，直至術后第4周

6、旋轉行為達到7轉/分以上，并保持基本穩(wěn)定至第16周。 2.高效液相色譜-電化學法(HPLC-EC)組織勻漿檢測非注射側和注射側黑質中DA含量由0.79nmol/l下降為0.26nmol/l，大約下降了67％，有顯著性差異。其代謝產物3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC)含量下降62.5％。 3.TH免疫組織化學染色可見TH陽性神經元分布于黑質和腹側被蓋部，其形態(tài)為大多角形或錐形細胞，胞漿棕染。半定量分析結果統(tǒng)計后顯示：注射生

7、理鹽水組大鼠黑質部位左、右兩側TH免疫陽性產物數量無顯著性差異；術后4周，6-OHDA注射組大鼠黑質部位左、右兩側TH免疫陽性產物數量存在顯著性差異(P＜0.05)；6、8、12、16周后，注射組大鼠黑質部位左、右兩側TH免疫陽性產物數量均存在極顯著性差異(P＜0.01)。 在第二部分實驗中，采用SSH技術比較PD模型健側與患側紋狀體組織細胞間mRNA的表達差異，結合分子克隆和反向Northern雜交技術，構建了差異表達cDNA

8、文庫。初步篩選和分析了6個上調表達克隆和6個下調表達克隆。功能上較明確的有：高親和谷氨酸轉運體(slcla1)；轉鐵蛋白受體(TrfR)；REST/NRSF相互作用限制結構域蛋白(RILP)；重組胰島素樣生長因子(Mtpn)；不均一核糖核酸核蛋白A/B(Hnrpab)；巖藻糖-1-磷酸鳥苷酰基轉移酶(Fpgt)；前列腺雄激素抑制信使1(Cipar1)；纖連蛋白5(fibulin5)；D123基因產物；白介素22α2受體(I122Rα2)

9、。 在第三部分實驗中，根據第二部分實驗結果，并結合文獻報道，構建pEGFP-Slclal真核表達質粒，轉染體外培養(yǎng)的神經膠質細胞，提取細胞液，觀察細胞提取液對C17.2神經干細胞增殖、分化的影響。實驗結果如下： 1.成功構建了真核表達重組質粒pEGFP-slclal。 2.成功轉染pEGFP-Slclal重組子進入培養(yǎng)的神經膠質細胞，可見神經膠質細胞有較多綠色熒光蛋白表達；并且轉染pEGFP-Slclal重組子的

10、培養(yǎng)神經膠質細胞中S1clalmRNA呈高表達。 3.轉染pEGFP-Siclal重組子的培養(yǎng)神經膠質細胞提取液可以提高TH陽性細胞比例，但是與自然狀態(tài)分化差異不顯著(P＞0.05)；細胞提取液+細胞因子混合液能明顯提高TH陽性細胞含量，與自然狀態(tài)分化相比具有顯著差異(P＜0.01)。 總之，在6-OHDA制備單側PD大鼠模型中，其患側與健側紋狀體細胞內確實存在多種mRNA的差異表達。對構建的差異表達cDNA文庫進行的初