Homer和Shank基因表達改變在腦損傷和腦膠質瘤病理過程中的意義.pdf

1、本研究主要分為兩部分。
　　第一部分：腦損傷后腦內Homer與Shank基因的改變及意義
　　腦損傷主要包括創(chuàng)傷性腦損傷（Traumaticbraininjury，TBI）和缺血性腦損傷，殘、死率高[1-2]。腦損傷的發(fā)生、發(fā)展可能與谷氨酸神經毒性、鈣離子超載、炎癥反應和血-腦脊液屏障破壞等因素有關，但其確切的分子病理機制尚不清楚，這是治療效果差的根本原因[3-4]。我們曾在體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經元機械性損傷模型上，發(fā)現(xiàn)一種

2、即早基因(immediatelyearlygene，IEG)Homer及其下游分子Shank，能調控多種細胞分子，通過多種信號通路廣泛參與腦損傷發(fā)生、發(fā)展的核心過程[5]。本課題擬在以往工作基礎上，通過在體動物的多種腦損傷模型，如側向瞬時旋轉致彌漫性軸索損傷（diffuseaxonalinjury，DAI）模型、Marmarou加速致彌漫性腦損傷（diffusebraininjury，DBI）模型及缺血性腦損傷模型，檢測Homer和Sh

3、ank在損傷腦組織中的表達及其意義，為探索腦損傷的發(fā)生機制及其相關治療提供理論依據(jù)。
　　實驗一、大鼠DAI后，腦內Homer的表達改變及意義
　　目的：研究大鼠DAI后，腦內Homer蛋白各亞型表達變化規(guī)律及意義。方法：選擇成年雄性SD大鼠120只，隨機分為正常對照組、假手術組與DAI后30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h及72h共10組，每組12只；應用側向瞬時旋轉致DAI，取大鼠腦干區(qū)主要核團、皮層和海

4、馬組織進行檢測；采用免疫組化染色法行免疫組化評分檢測；Westernblot法行蛋白測定；實時熒光定量RT-PCR法行mRNA測定。結果：①免疫組織化學法結果顯示，正常對照組和假手術組中神經元Homer1a染色呈陰性，DAI組神經元Homer1a染色呈陽性，陽性染色呈顆粒狀分布于胞漿、胞膜及突起結構；傷后30minHomer1a蛋白出現(xiàn)表達，一直持續(xù)至傷后72h，與正常對照組和假手術組Homer1a蛋白免疫評分相比，DAI后24h出現(xiàn)表

5、達高峰（P<0.01）；Homer1b/c在各組神經元中均有一定程度表達，但表達量無明顯變化；②與正常對照組和假手術組相比較，在DAI后30min，Homer1a蛋白及其mRNA開始表達，1h～72h表達量明顯增加，在24h達到高峰（P<0.01），但72h仍維持較高水平（P<0.05）；③Homer1b/c在正常對照組、假手術組和DAI組神經元中均有一定程度表達，無論蛋白還是mRNA表達水平，其表達量均無明顯變化(P>0.05)；DA

6、I④后，在30min～24h，腦干Homer1a蛋白及其mRNA表達量均大于皮層和海馬（P<0.05），但在48～72h無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；其在皮層和海馬之間無差異（P>0.05）；Homer1b/c蛋白及其mRNA表達量在上述三個部位也無差異（P>0.05）。結論：DAI刺激可誘導Homer1a基因快速表達，可能與DAI后，大量谷氨酸釋放，細胞興奮性增加有關，而Homer1b/c表達不受神經元興奮性活動調節(jié)。結合以往文獻認為

7、，DAI后，動態(tài)表達的Homer1a與持續(xù)表達的Homer1b/c共同調節(jié)mGluR1a的結構和功能，其機制可能是Homer1a與Homer1b/c競爭結合mGluR1a，減少細胞內Ca2+超載，調節(jié)mGluR1a在突觸部位的分布及受體信號傳遞效率，防止mGluR1a過度興奮。神經元興奮性增高時，Homer1a表達增加，這是一種自然的、選擇性地調節(jié)mGluR1a與Homer1b/c結合的負反饋機制。而腦組織不同部位Homer1a表達量存

8、在差異可能與側向旋轉DAI致傷模型造成中線部分受損最嚴重有關，提示根據(jù)Homer1a表達量多少可判斷腦損傷嚴重程度。
　　實驗二、大鼠DBI后，腦內Homer的表達改變及意義
　　目的：研究大鼠DBI后，腦內Homer蛋白各亞型表達變化規(guī)律及意義。方法：選擇成年雄性SD大鼠120只，隨機分為正常對照組、假手術組DBI后30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h及72h共10組，每組12只；采用Marmarou加速致

9、DBI模型，其它檢測內容和方法同實驗一。結果：①免疫組織化學法結果顯示，正常對照組和假手術組中神經元Homer1a染色呈陰性，DBI組神經元Homer1a染色呈陽性，陽性染色呈顆粒狀分布于胞漿、胞膜及突起結構；傷后30minHomer1a蛋白開始表達，一直持續(xù)至傷后72h，與正常對照組和假手術組Homer1a蛋白免疫評分相比，DBI后24h出現(xiàn)表達高峰（P<0.01），同時，Homer1a在損傷膠質細胞中也表達；Homer1b/c在各組

10、神經元中均有一定程度表達，但表達量無明顯變化；②與正常對照組和假手術組相比，DBI后3h和24h，Homer1a蛋白及其mRNA表達量出現(xiàn)2個峰值（P<0.01），72h時仍維持較高水平（P<0.05）；③Homer1b/c結果同實驗一結果；④DBI后30min～24h，Homer1a蛋白及其mRNA表達量在皮層和海馬均大于腦干的相應值（P<0.05），而在48～72h兩者無差異（P>0.05）；實驗中，Homer1a蛋白及其mRNA表

11、達量在皮層和海馬之間無差異改變（P>0.05），而且，Homer1b/c蛋白及其mRNA表達量在腦干、皮層和海馬之間也無差異改變（P>0.05）。結論：DBI后Homer1a表達有兩個高峰，第一個高峰的出現(xiàn)可能與早基因蛋白Homer1a競爭性與Homer1b/c結合代謝性谷氨酸受體，降低其在突觸部位的聚集量，減少細胞內Ca2+超載有關；第二個高峰的出現(xiàn)可能與Homer1a還可能參與促進受損神經元和膠質細胞病理性凋亡有關，這種Homer1

12、a蛋白上調可能對受損腦組織有保護作用。另外，與實驗一DAI后的結果不同，Homer1a表達量在海馬和皮層明顯增高，這可能與模型不同、海馬和皮層受損更嚴重、發(fā)生機制不同有關。
　　實驗三、大鼠缺血再灌注腦損傷后，腦內Homer的表達改變及意義
　　目的：研究大鼠缺血再灌注腦損傷后，腦內Homer蛋白各亞型表達變化規(guī)律及意義。方法：選擇成年雄性SD大鼠120只，隨機分為正常對照組、假手術組與缺血再灌注腦損傷后30min、1h、3

13、h、6h、12h、24h、48h及72h共10組，每組12只；采用大腦中動脈阻塞致缺血再灌注損傷模型（MCAO），其它檢測內容和方法同實驗一。結果：①免疫組織化學法結果顯示，正常對照組和假手術組中神經元Homer1a染色呈陰性，損傷組神經元Homer1a染色呈陽性，陽性染色呈顆粒狀分布于胞漿、胞膜及突起結構；缺血再灌注損傷后30minHomer1a蛋白開始表達，一直持續(xù)至傷后72h，與正常對照組和假手術組Homer1a蛋白免疫評分相比，

14、損傷后24h出現(xiàn)表達高峰（P<0.01），同時，Homer1a在損傷膠質細胞中也表達；Homer1b/c在各組神經元中均有一定程度表達，但表達量無明顯變化；②與正常對照組和假手術組相比，缺血再灌注腦損傷后，Homer1a蛋白及其mRNA表達量出現(xiàn)30min（P<0.01）、3h（P<0.01）和24h（P<0.01）3個高峰，72h時仍維持較高水平（P<0.05）；③Homer1b/c結果同實驗一結果。結論：首先，缺血再灌注損傷后Hom

15、er1a表達有三個高峰，傷后30min出現(xiàn)的第一個高峰，可能與缺血損傷和再灌注損傷“疊加”，在損傷早期共同刺激及早基因Homer1a大量表達，與Homer1b/c競爭結合mGluRs，降低其在突觸部位的聚集量，減少細胞內Ca2+超載有關，DBI后無此表達高峰。其余兩個表達高峰則與Homer1a調節(jié)mGluRs分布，及促進神經元和膠質細胞病理性凋亡有關；其次，缺血再灌注腦損傷后Homer1a表達時空變化規(guī)律與上述兩個實驗結果不同，可能與發(fā)

16、生機制不同，缺血性腦損傷病理生理過程牽涉更多、更復雜信號通路有關。
　　實驗四、大鼠腦損傷后，腦內Shank各亞型的表達改變及意義
　　Shank是一種多結構域的骨架蛋白，可介導多種蛋白連接而成功能復合體，包括3個亞型，Shank1，Shank2和Shank3，在神經系統(tǒng)有廣泛分布，對于維持神經元突觸的形態(tài)和功能有重要作用[6-7]。文獻報道，Shank蛋白通過調控Homer蛋白與mGluRs的錨定與信號傳導過程，參與了突觸

17、可塑性、學習和記憶等的病理生理機制。但是腦損傷后不同亞型Shank蛋白的表達時空變化規(guī)律，以及與腦損傷的關系等都未見報道。
　　目的：本課題擬在以往工作基礎上，通過上述3種在體動物腦損傷模型，初步檢測腦損傷后不同亞型Shank蛋白的表達時空變化規(guī)律以及與腦損傷的關系，力求尋找出關鍵性Shank分子，為探索腦損傷的發(fā)病機制及其相關治療提供了實驗依據(jù)。方法：取上述3種模型致?lián)p傷后的大鼠皮層組織進行檢測。采用免疫組化染色法和Wester

18、nblot法行蛋白定位定量測定，實時熒光定量RT-PCR法行mRNA測定。結果：①免疫組織化學法結果顯示，在3種模型中，腦損傷前后，Shank的3個亞型-Shank1、Shank2和Shank3都陽性表達，它們的陽性染色都呈顆粒狀分布于胞漿、胞膜及突起結構。DAI②后，Shank的蛋白定量和mRNA定量檢測結果一致。Shank1，在所有組別都高表達，無變化趨勢，損傷前后表達量一致（P>0.05）；Shank2，正常組和假手術組都有表達，

19、DAI后30min其表達量開始增加，6h達到高峰（P<0.01），隨后下降，72h又出現(xiàn)表達高峰（P<0.01）；Shank3，正常組和假手術組都有表達，DAI后，30min到6h一直高表達（P<0.01），然后開始下降，至72h仍維持較高水平（P<0.05）。③DBI后，Shank的蛋白和mRNA定量檢測結果一致。Shank2，正常組和假手術組都有表達，DBI后30min其表達量開始增加，在3h到6h期間達到高峰（P<0.01），而D

20、BI前后Shank1和Shank3亞型表達變化結果，和DAI前后此兩個亞型結果基本一致。④缺血再灌注損傷后，Shank的蛋白和mRNA定量檢測結果一致。Shank1，正常組和假手術組都有表達，損傷后30min其表達量開始增加，出現(xiàn)2個高峰，3h（P<0.01）和12h（P<0.01），隨后下降，至72h仍維持較高水平（P<0.05）；Shank2，在所有組別都高表達，無變化趨勢，損傷前后表達量一致（P>0.05）；Shank3，正常組和