HIBD新生鼠Foxg1基因與腦皮質(zhì)特定基因表達(dá)的相關(guān)性.pdf

1、研究背景：新生兒窒息致缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemicbrain damage，HIBD)是新生兒期常見的臨床疾病，已成為導(dǎo)致兒童腦癱、嚴(yán)重危害新生兒健康成長的重要原因。2003年我國進(jìn)行第二次多中心治療觀察重度HIBD的預(yù)后，發(fā)現(xiàn)預(yù)后不良率仍高達(dá)20.8％，因此目前的治療手段對中重度HIBD的療效仍然很有限。近年對干細(xì)胞的研究表明，新生動物腦內(nèi)存在神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSC)，在HIBD后

2、，內(nèi)源性NSC可反應(yīng)性增殖、分化以促進(jìn)腦結(jié)構(gòu)及功能的改善。但內(nèi)源性NSC反應(yīng)性增殖、分化的力度很有限，其分化率較低。Liu等采用 5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標(biāo)記技術(shù)追蹤觀察HIBD后海馬齒狀回新生NSC分化為神經(jīng)元的情況，發(fā)現(xiàn)在HIBD后15天，未見NSC分化為成熟神經(jīng)元，在26天后也僅有27％的BrdU陽性細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元。Masanori等追蹤觀察HIBD后沙鼠室管膜下區(qū)

3、及顆粒層NSC增殖及分化情況，表明在HIBD后10天室管膜下區(qū)NSC增加了3倍，追蹤觀察到60天也僅有少數(shù)細(xì)胞分化為表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP，成熟星型膠質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志)的星型膠質(zhì)細(xì)胞和表達(dá)神經(jīng)元特異性核抗原(neuron-specific nuclear antigen，NeuN，成熟神經(jīng)元表面標(biāo)志)的神經(jīng)元。因此，如何提高內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在腦內(nèi)的增殖和神經(jīng)性分化

4、效率，真正發(fā)揮干細(xì)胞的替代修復(fù)作用值得深入研究。近年來研究表明，干細(xì)胞在腦內(nèi)的分化受局部微環(huán)境影響。因此，在HIBD后的病態(tài)微環(huán)境中是否存在某種因素抑制了內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞再生和神經(jīng)性分化，從而導(dǎo)致內(nèi)源性NSC的分化率較低，難以有效的重建大腦結(jié)構(gòu)及功能值得深入研究。如能找到這一抑制性因素并采取針對性治療措施，將有望全面改善HIBD預(yù)后。 Foxg1基因是 FOX基因家族的一個重要成員，研究表明胚胎大腦發(fā)育過程中干細(xì)胞的增殖、分化受到關(guān)鍵基

5、因Foxgl的調(diào)控，該基因的表達(dá)缺陷將導(dǎo)致干細(xì)胞發(fā)育分化障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育缺陷，且正常出生后Foxg1仍然持續(xù)表達(dá)于由端腦分化來的腦組織(大腦皮質(zhì)、海馬、嗅球及基底核等)中，而發(fā)生HIBD時正是這些腦組織容易受到損傷。新生動物HIBD后腦結(jié)構(gòu)與功能重建是胚胎期發(fā)育的再現(xiàn)和延續(xù)，因而Foxg1基因可能在HIBD后干細(xì)胞分化增殖的過程中扮演一重要角色因素。 目的：觀測HIBD后 Foxg1基因和腦皮質(zhì)各層特定基因(Foxp

6、2，ER81，Otx1，F(xiàn)oxp1，RORβ)表達(dá)的動態(tài)變化分析兩者的相關(guān)性，初步探討是否存在HIBD后Foxg1基因水平的下降導(dǎo)致大腦皮質(zhì)自身修復(fù)受限，表現(xiàn)為各層結(jié)構(gòu)特定基因表達(dá)下調(diào)；觀測卡哈爾-雷濟(jì)厄斯細(xì)胞(Cajal-Retzius cells，CR 細(xì)胞)在發(fā)生HIBD后的變化情況，初步探討是否存在內(nèi)源性NSC向CR細(xì)胞分化增多，而向其它皮質(zhì)層的成熟神經(jīng)細(xì)胞分化減少的現(xiàn)象。 方法：采用Rice法制作新生鼠HIBD動物模型

7、，假手術(shù)組作為對照組，分別在術(shù)后第3、7、14、28、56天取右側(cè)腦半球。半定量RT-PCR檢測標(biāo)本中各個基因的表達(dá)，免疫組化檢測標(biāo)本CR細(xì)胞數(shù)目變化。 結(jié)果： 1.模型鑒定：常規(guī)HE染色檢查結(jié)果顯示結(jié)扎側(cè)出現(xiàn)明顯的病理變化，病變在大腦皮層和海馬尤為明顯，主要為神經(jīng)元壞死，表現(xiàn)為空泡、核固縮、組織結(jié)構(gòu)模糊及炎癥細(xì)胞增多等。 2.半定量RT-PCR結(jié)果： (1)Foxg1基因：Foxg1基因的表達(dá)在術(shù)后第3

8、、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.524±0.086，0.726±0.067，0.770±0.122，0.786±0.083，0.882±0.081；對照組的結(jié)果分別為0.798±0.121，0.787±0.078，0.664±0.109，0.744±0.096，0.757±0.065。兩組比較在第3天和第56天有顯著性差異?？傮w上模型組Foxg1基因的表達(dá)在早期出現(xiàn)明顯下調(diào)隨著時間的推移呈現(xiàn)出上升趨勢而對照組Foxg1基因表達(dá)相

9、對較穩(wěn)定。 (2)Reelin基因：Reelin基因的表達(dá)在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.591±0.034，0.542±0.131，0.533±0.085，0.694±0.063，0.668±0.144；對照組的結(jié)果分別為0.565±0.113，0.329±0.062，0.474±0.081，0.553±0.073，0.618±0.104。兩者比較在第7天和第28天有顯著性差異?？傮w上模型組Reelin基因的

10、表達(dá)量在各個時間點均高于對照組。 (3)Foxp1基因：Foxp1基因的表達(dá)在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.616±0.056，0.886±0.096，0.710±0.059，0.636±0.070，0.698±0.109；對照組的結(jié)果分別為0.737±0.115，0.743±0.102，0.746±0.108，0.735±0.082，0.899±0.064。兩者比較在第3、7、28和56天有顯著性差異?？傮w上

11、模型組Foxp1基因的表達(dá)水平是低于對照術(shù)組。 (4)ER81基因：ER81基因的表達(dá)在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.654±0.096，0.942±0.068，0.724±0.094，0.838±0.105，0.977±0.123；對照組的結(jié)果分別為0.710±0.120，0.666±0.139，0.797±0.107，0.941±0.141，1.027±0.113。兩者比較在第7天有顯著性差異。總體上模型組

12、基因的表達(dá)水平低于對照組。 (5)Otx-1基因：術(shù)后第3天模型組Otx-1基因的表達(dá)未能檢測出而對照組正常測出。從術(shù)后第7天開始模型組和對照組均能夠檢測出，且在第7天后模型組Otx-1的表達(dá)水平高于對照組。模型組的表達(dá)在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.000±0.000，0.713±0.122，0.570±0.134，0.535±0.037，0.551±0.044；對照組的結(jié)果分別為0.571±0.098，0.

13、466±0.137，0.463±0.133，0.462±0.121，0.401+0.061。兩者比較在第7天和第56天有顯著性差異。 (6)RORβ基因：RORβ基因的表達(dá)在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為00.951±0.118，0.839±0.078，0.786±0.114，0.828±0.109，1.120±0.204；對照組的結(jié)果分別為0.984±0.133，0.868±0.169，1.060±0.225，1

14、.238±0.155，0.854±0.094。兩者比較在第14、28和56天有顯著性差異?？傮w上在發(fā)生HIBD后的前期RORβ基因的表達(dá)是降低的。 (7)Foxp2基因：Foxp2基因的表達(dá)在術(shù)后第3、7、14、28、56天的結(jié)果分別為0.460±0.107，0.526±0.119，0.566±0.164，0.455±0.050，0.570±0.061；對照組的結(jié)果分別為0.543±0.104，0.420±0.163，0.452

15、±0.055，0.469±0.043，0.422±0.055。兩者比較在第14天和第56天有顯著性差異?？傮w上在發(fā)生HIBD后的前期Foxp2基因的表達(dá)是降低的。 3.免疫組織化學(xué)結(jié)果：在進(jìn)行免疫組化染色之后結(jié)果顯示模型組隨著時間的推移Reelin抗原陽性細(xì)胞(主要為CR細(xì)胞>增生明顯，而對照組細(xì)胞數(shù)目變化不大。鏡下顯示增生的陽性細(xì)胞分布不均且有團(tuán)狀聚集傾向。模型組在第3、7、14、28、56天的陽性細(xì)胞數(shù)分別為24.9±2.4

16、24，31.4±4.452，42.3±2.908，47.1±1.853，45.5±2.173個；對照組陽性細(xì)胞數(shù)分別為21.7±2.627，21.7±3.199，21.8±3.190，22.4±2.221，27±2.000個。兩者在各個時間點比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)。 4.統(tǒng)計學(xué)結(jié)果：正常情況下即對照組中Otx1基因與Foxg1基因的表達(dá)呈正相關(guān)而模型組Otx1基因與Foxg1基因的表達(dá)卻變成了負(fù)相關(guān)，Reeli

17、n基因與Foxg1基因的表達(dá)在對照組中呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)而模型組中卻變成了正相關(guān)，F(xiàn)oxp1、ER81、RORβ、Foxp2基因與Foxg1基因的關(guān)系在對照組和模型組中均呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)性。 結(jié)論：HIBD后新生鼠腦組織中Foxg1基因表達(dá)下調(diào)，皮質(zhì)特定基因Reelin基因表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)oxp2，ER81，Otx1，F(xiàn)oxp1和RORβ基因表達(dá)下調(diào)。由于HIBD后早期腦組織Foxg1基因的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致內(nèi)源性NSC向CR細(xì)胞分化增加而向各層腦皮