Daple基因在鼠腦內(nèi)及體內(nèi)的空間分布表達(dá).pdf

1、研究目的:
　　Daple又稱為含有高亮氨酸殘基的Dvl相關(guān)蛋白。Daple是Girdin家族的基因(Girdin，Daple，F(xiàn)LJ004354)。其中Daple和Girdin在N端有很大的同源性，(54％的氨基酸相同)，意味著兩個基因功能相似，而C末端則與Girdin較少的相似性，只有27％，這意味著Daple具有不同于Girdin的特殊功能。Daple在Wnt經(jīng)典途徑中抑制β-catenin聚集和T細(xì)胞因子(Tcf)的轉(zhuǎn)錄活

2、性，起負(fù)調(diào)節(jié)作用。而在非經(jīng)典Wnt通路中增加蛋白激酶C(PKC)與Dvl互相作用激活Rac蛋白，起正調(diào)節(jié)作用。目前已知Daple在出生后期細(xì)胞遷移中起著重要的作用，Daple可能會影響胚胎發(fā)育、血管發(fā)生和腫瘤發(fā)展。目前哺乳動物Daple的分布表達(dá)的仍不明確。因此，全面了解Daple蛋白的功能及分布對于進(jìn)一步了解相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及預(yù)后有重要意義。本研究重點(diǎn)是Daple基因的表達(dá)分布。
　　材料與方法:
　　通過SA剪接受體技

3、術(shù)制作的Daple基因敲除的老鼠購自transgenic公司。出生7天的老鼠（p7;雌性）和8周老鼠（p56;雄性）(野生型老鼠(+/+)同源性老鼠(-/-))用4％PFA灌注，解剖出組織、冰凍、冰凍切片，解凍安裝在載玻片上。Daple分布可以通過LacZ染色顯示并可以應(yīng)用原位雜交技術(shù)驗證LacZ染色的結(jié)果。用33p或地高辛標(biāo)記的DaplecRNA探針（外顯子30）。根據(jù)daple基因在腦中的分布，進(jìn)一步對神經(jīng)進(jìn)行免疫組化染色，用PGP

4、9.5，GFAP標(biāo)記，判定daple基因是在神經(jīng)元或是膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。根據(jù)其分布的特點(diǎn)對腦內(nèi)可能出現(xiàn)的異常酶進(jìn)行PCR和RT-PCR分析。
　　結(jié)果:
　　我們發(fā)現(xiàn)LacZ染色的p7和p56的同源性Daple敲除的小鼠在紋狀體、腦室室管膜細(xì)胞、小腦（大概在皮質(zhì)上的浦肯野細(xì)胞）、海馬、嗅球、脊髓、氣管、膀胱、毛囊、舌、胃、脾、胰腺、心肌細(xì)胞、視網(wǎng)膜、腎乳頭和門靜脈，beta-geo(Daple啟動子介導(dǎo)LacZ和抗新霉素基因融合

5、)表達(dá)而野生型小鼠不表達(dá)。原位雜交技術(shù)也證實(shí)了這個結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)在脈絡(luò)叢和海馬CA3區(qū)，Daple在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而在紋狀體中，Daple同時在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。酪氨酸羥化酶(TH)RT-PCR和realtimePCR的結(jié)果顯示同源性Daple敲除小鼠和野生型小鼠在酪氨酸羥化酶表達(dá)中并沒有顯著性差異。
　　結(jié)論:
　　我們成功的描述出Daple的基因表達(dá)。Daple在腦、脊髓、眼、膀胱上皮及平滑肌、支氣管上皮、

6、胃、腎臟、睪丸、輸精管、毛囊、舌、門靜脈表達(dá)顯著。Daple在小鼠腦中的分布主要在紋狀體、海馬、齒狀回、皮質(zhì)、黑質(zhì)和室管膜細(xì)胞上。在脈絡(luò)叢和海馬CA3區(qū)，Daple在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在紋狀體中Daple同時在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。通過酪氨酸羥化酶PCR的結(jié)果顯示同源性Daple敲除小鼠和野生型小鼠在酪氨酸羥化酶表達(dá)中并沒有顯著性差異，提示同源型敲除小鼠中多巴胺含量與野生型小鼠區(qū)別不大。希望通過了解Daple在小鼠全身器官、中樞神