豬生長激素基因在動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)染和表達(dá)研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室將克隆到的豬生長激素(pGH)基因亞克隆到真核表達(dá)載體VRl020上得到pGH基因以正確方向插入的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，命名為VpGH。將此重真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPl0F'，用質(zhì)粒PCR和酶切的方法驗(yàn)證此重組質(zhì)粒為正確插入pGH。大量制備VpGH。以薄膜法制備脂質(zhì)體，用這種脂質(zhì)體包裹VpGH。我們初步研究了脂質(zhì)體包裹VpGH這種新型基因制劑的性質(zhì)；探索了脂質(zhì)體包裝VpGH轉(zhuǎn)染動(dòng)物的增重效果和pGH基因在動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)。用此脂

2、質(zhì)體包裹VpGH，單獨(dú)注射21日齡昆明小鼠后，分別在注射后的O，1，2，3，4，5周稱其體重，同時(shí)每周用斷尾采血分離血清，用ELISA分析免疫小鼠GH，IgG水平，檢測(cè)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)量的變化，觀察此VpGH脂質(zhì)體包裝后對(duì)小鼠的增重效應(yīng)和免疫保護(hù)的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：脂質(zhì)體包裝VpGH注射小鼠的組較對(duì)照組體重增加均顯著提高(P<0.05)，較空白組體重增加也有顯著提高(P<0.05)，最高在第四周比對(duì)照增重率高2

3、0個(gè)百分點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)的六周內(nèi)注射VpGH組平均每天增重0.65g，而對(duì)照組平均每天增重O.54g。細(xì)胞免疫指標(biāo)較對(duì)照組和空白組均明顯提高，使用大腸桿菌弱毒株攻毒結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同劑量下注射VpGH部分小鼠健康存活，而對(duì)照組小鼠發(fā)病，出現(xiàn)以胃、十二指腸、空腸粘膜等處出血、肝脾腫大等為主的病變。這些結(jié)果表明：此脂質(zhì)體包裹VpGH可促進(jìn)小鼠生長同時(shí)增強(qiáng)小鼠體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，增強(qiáng)對(duì)微生物感染的抵抗力。 每周將注射VpGH的小鼠殺死一只，取其

4、心，肝，脾，腎，肌肉用于表達(dá)研究。從心，肝，脾，腎，肌肉中提取總的DNA,用PCR的方法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在各個(gè)組織中均無pGH基因整合到宿主基因組上的現(xiàn)象，說明轉(zhuǎn)染動(dòng)物的質(zhì)粒是在動(dòng)物細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的。從心，肝，脾，腎，肌肉組織提取總蛋白，經(jīng)westen_blot分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肌肉組織中GILt表達(dá)明顯增加。根據(jù)小鼠實(shí)驗(yàn)所得到的結(jié)果我們將這種基因制劑在豬身上做了實(shí)驗(yàn)。將脂質(zhì)體包裹VpGH注射實(shí)驗(yàn)豬，在0,2,4,6周檢測(cè)了對(duì)豬的增重和GH的表

5、達(dá)量。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組對(duì)比，白豬的增重增加明顯，在第二周，第六周注射VpGH組增重和對(duì)照相比達(dá)到顯著水平，增重率在第六周比對(duì)照高達(dá)50個(gè)百分點(diǎn)。白豬注射脂質(zhì)體包裹VpGH的組平均增重達(dá)到0.5Kg/天，對(duì)照僅有0.3Kg/天?；ㄘi組增重不明顯，平均增重都在0.3Kg/天左右。對(duì)照小鼠實(shí)驗(yàn)，所有這些結(jié)果都提示脂質(zhì)體包裹VpGH基因制劑既能促進(jìn)動(dòng)物的生長，又可以部分增強(qiáng)動(dòng)物的免疫機(jī)能和免疫應(yīng)答反應(yīng)；增強(qiáng)對(duì)傳染病的抗病力，有望成為