豬生長(zhǎng)激素基因cDNA克隆與表達(dá)效應(yīng)研究.pdf

1、以豬腦垂體總RNA為模板， 5'-CTAGGATCC CCG GCT GTG ATG GCTGCA-3'(BamHI)和5'-CA GAATTC GCA.ACA GAG ATG CCC AG-3'(EcoRI)為引物，通過(guò)RT-PCR克隆了豬生長(zhǎng)激素(pGH)基因編碼區(qū)cDNA。豬生長(zhǎng)激素基因pGH cDNA ORF編碼216個(gè)氨基酸殘基。該cDNA編碼蛋白序列與已有報(bào)道的大河豬(Dahe)pGH 100％同源，而與其它地方豬種的pGH

2、前體蛋白序列的同源性為98.6％～99.5％。 豬生長(zhǎng)激素基因的原核表達(dá)及其抗體制備：將pGH基因亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX4T-1中，構(gòu)建了重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-1/pGH。誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果表明出現(xiàn)與預(yù)期一致的1條50.4KDa的特異蛋白新帶，重組pGH得到了正確表達(dá)。分離包涵體形式表達(dá)的融合蛋白GST-pGH，透析得到的重組融合蛋白進(jìn)行家兔免疫，制備并純化抗pGH的多克隆抗體；經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)

3、定、蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)，結(jié)果證實(shí)制備的抗血清對(duì)豬生長(zhǎng)激素具免疫特異性。采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化的兔抗pGH多克隆抗體達(dá)到SDS-PAGE純；Western Blotting檢測(cè)結(jié)果表明：豬天然pGH蛋白(24.4 KDa)和融合表達(dá)蛋白GST-pGH(50.4KDa)能特異性結(jié)合該pGH多抗，豬腦垂體組織的免疫組化分析結(jié)果也證實(shí)了pGH多克隆抗體的特異性。 通過(guò)構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pPIC-3.5K/pGH，我們研究

4、了豬生長(zhǎng)激素基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá)。將豬生長(zhǎng)激素(pGH)基因cDNA編碼區(qū)片斷定向插入pMD18-T質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，用菌落PCR和質(zhì)粒PCR方法篩選陽(yáng)性克?。灰訠amH I和EcoRI酶切鑒定重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒用BamH I和EcoR I酶切，膠回收目的酶切片斷并定向插入pPIC-3.5K質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為pPIC-3.5K/pGH。該重組質(zhì)粒經(jīng)Sail酶切線性化處理后電擊轉(zhuǎn)化GS115酵母，采用MD和MM培養(yǎng)基篩選

5、重組子，提取初篩重組子的基因組DNA。PCR方法進(jìn)一步鑒定，獲得的重組酵母菌以甲醇誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白表達(dá)，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western-blot分析，復(fù)篩得到高效表達(dá)pGH的重組酵母，命名為pPIC-3.5K/pGH/GS115。SDS-PAGE和Western-blot分析證明重組酵母誘導(dǎo)表達(dá)了pGH蛋白，分子量接近25KDa，與預(yù)期的24.4KDa的豬生長(zhǎng)激素基因編碼蛋白質(zhì)大小一致。豬生長(zhǎng)激素基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)：將pGH

6、 cDNA亞克隆到真核表達(dá)載體VR1020上，構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒VpGH；利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞株COS<,7>，分別于24h、48h、72h提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，對(duì)轉(zhuǎn)染后的COS<,7>細(xì)胞進(jìn)RT-PCR、ELISA和免疫熒光分析。RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)總RNA中已含有目的cDNA片段轉(zhuǎn)錄的對(duì)應(yīng)mRNA；ELISA和免疫熒光分析結(jié)果表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的COS<,7>細(xì)胞中表達(dá)了pGH基因的蛋白產(chǎn)物。 本