水貂生長激素cDNA的克隆與原核表達(dá)的相關(guān)研究.pdf

1、水貂生長激素(minkgrowthhormone，mGH)是由腦垂體前葉細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，它是具有廣泛的生理功能。人工注射動物自身的生長激素，可以明顯加快其生長速度，增加體長，提高毛皮質(zhì)量。但從水貂腦垂體提取天然生長激素產(chǎn)量甚微，難以大范圍的應(yīng)用到生產(chǎn)實踐，而基因工程技術(shù)的發(fā)展為有效的解決這一問題提供了可能。 本實驗采用Trizol一步法從水貂(Mustelavison)腦垂體中分離提取總RNA。根據(jù)GenBank發(fā)表的

2、水貂生長激素cDNA設(shè)計兩對特異的引物，通過RT-PCR分別擴(kuò)增出水貂生長激素前體肽和成熟肽cDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收純化，分別克隆到載體pGEM-T，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α。在含X-gal、IPTG的LB(Amp+)平板上通過藍(lán)白斑篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒作限制性酶切鑒定后，對重組子上的目的片段進(jìn)行測序。結(jié)果表明RT-PCR擴(kuò)增出的兩個cDNA片段堿基數(shù)分別為713bp和780bp，用DNAsis2.5軟件進(jìn)行分析表

3、明此擴(kuò)增序列與GenBank中發(fā)表的水貂生長激素cDNA100％同源。前體肽編碼區(qū)由651bp組成，編碼216個氨基酸，包括長度為29個氨基酸的信號肽；成熟肽的開放閱讀框全長564bp，編碼187個氨基酸，分子量約為21kDa，等電點為7.09。 采用DNA重組技術(shù)，將已克隆到的水貂生長激素成熟肽cDNA片段定向插入表達(dá)載體pET28b(+)質(zhì)粒中，經(jīng)過酶切鑒定以及序列測定可以證實，已獲得原核表達(dá)載體pET-mGH2。將表達(dá)載體

4、通過CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，用菌落PCR方法篩選陽性克隆，以BamHI和XhoI酶切鑒定重組質(zhì)粒，以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，SDS-PAGE未能檢測到目的蛋白。因此，為了提高表達(dá)量，我們在保證mGH氨基酸不變的前提下，對mGH基因的cDNA5’端的兩個堿基進(jìn)行突變，將突變的mGH構(gòu)建表達(dá)載體pET-mGH3，以IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，通過RT-PCR及SDS-PAGE進(jìn)行表達(dá)分析。RT-PCR分析表明，突變后的pET