熒光蛋白標(biāo)記的t-PAEGF缺失基因在雞體內(nèi)定位表達(dá)及靶向轉(zhuǎn)運(yùn).pdf

1、分類號(hào) 密級(jí) UDC 編號(hào) 碩 士 學(xué) 位 論 文 熒光蛋白標(biāo)記的 t-PA EGF 缺失基因在雞體內(nèi)定位表達(dá)及靶向轉(zhuǎn)運(yùn) 學(xué) 位 申 請(qǐng) 人： 人： 王曉利 指 導(dǎo) 教 師： 師： 李銀聚 教授 學(xué) 科

2、 專 業(yè)： 業(yè)： 基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué) 學(xué) 位 類 別： 別： 農(nóng) 學(xué) 2011 年 5 月 摘 要 I 論文題目 論文題目：熒光蛋白標(biāo)記的 熒光蛋白標(biāo)記的 t-PA EGF 缺失基因在雞體內(nèi) 缺失基因在雞體內(nèi) 定位表達(dá)及靶向轉(zhuǎn)運(yùn) 定位表達(dá)及靶向轉(zhuǎn)運(yùn) 專 業(yè)： 業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué) 基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)

3、 研 究 生： 生：王曉利 王曉利 指導(dǎo)教師： 指導(dǎo)教師：李銀聚 李銀聚 教授 教授 摘 要 人組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator, t-PA)在臨床上廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療。由于t-P

4、A溶栓作用強(qiáng)而又不引起全身性纖溶所導(dǎo)致的彌漫性出血，是目前防治血栓性疾病最為理想的藥物。apo-B100是極低密度脂蛋白Y(very low density lipoprotein，VLDLy)組裝和分泌所必需的載脂蛋白，也是VLDLy通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入卵母細(xì)胞的配體，VLDLy以完整的脂蛋白顆粒通過卵母細(xì)胞膜上的凹陷小泡以內(nèi)吞的形式進(jìn)入生長中的卵泡，實(shí)現(xiàn)在卵黃中的沉積。為探索t-PA在雞卵黃中定向積淀的可行性，開發(fā)具有抗心血管

5、疾病的功能性雞蛋，本研究將t-PA功能區(qū)基因片段與雞VLDLy組裝前體apo-B100基因進(jìn)行融合，利用綠色熒光蛋白的靈敏度高、便于檢測(cè)的特性，構(gòu)建熒光蛋白融合基因表達(dá)載體，電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌Δcrp SL1344，靜脈注射轉(zhuǎn)染初產(chǎn)蛋雞，對(duì)融合基因在雞體內(nèi)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物在卵黃的沉積進(jìn)行定性、定量以及活性檢測(cè)，為減毒沙門氏菌介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移和利用家禽作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)t-PA功能蛋白的研究奠定基礎(chǔ)。 本研究應(yīng)用分子生物學(xué)手段，設(shè)計(jì)一對(duì)

6、特異性引物，從已構(gòu)建的真核表達(dá)載體pCDNA3-apo-tPA上擴(kuò)增目的片段apo-tPA，并定向克隆到綠色熒光載體pEGFP-N1上，構(gòu)建pEGFP-N1-apo-tPA表達(dá)載體，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定基因讀碼框架正確后，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞，ELISA檢測(cè)融合蛋白表達(dá)水平，發(fā)色底物法檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物生物學(xué)活性。將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至減毒鼠傷寒沙門氏菌Δcrp SL1344，構(gòu)建重組減毒沙門氏菌Δcrp SL1344(pEGFP-N1-apo

7、-tPA)。重組菌經(jīng)翅下靜脈注射轉(zhuǎn)染雞體，每次間隔2d，收集不同時(shí)間生產(chǎn)的雞蛋，SDS-PAGE電泳和卵黃涂片熒光鏡檢方法檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)狀況，ELISA法檢測(cè)表達(dá)水平，平板溶圈法檢測(cè)生物學(xué)活性。結(jié)果顯示，克隆的apo-tPA融合基因片段長2 463bp；apo-tPA-GFP融合基因在體外培養(yǎng)的雞胚成纖維細(xì)胞中能夠表達(dá)并分泌到細(xì)胞外，融合蛋白在轉(zhuǎn)染后48h表達(dá)水平最高，達(dá)577.6ng/106細(xì)胞/24h，表達(dá)產(chǎn)物活性為148.3I