HLECs分離培養(yǎng)及VEGFR-3結(jié)合肽靶向卵巢癌新生淋巴管分子顯像的實驗研究.pdf

1、研究背景:卵巢癌(ovarian cancer)是女性常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤,早期診斷困難,易發(fā)生轉(zhuǎn)移,藥物治療效果差,死亡率高。因此尋求一個特異性的靶點進(jìn)行早期診斷或有效治療是目前卵巢癌研究亟待要解決的問題。對卵巢癌而言,淋巴道播散是轉(zhuǎn)移的主要途徑,淋巴管生成(lymphangiogenesis)促進(jìn)了卵巢癌的轉(zhuǎn)移浸潤。而淋巴管生成主要是毛細(xì)淋巴管的形成。研究顯示,腫瘤微淋巴管的形態(tài)結(jié)構(gòu)與正常組織中的微淋巴管明顯不同,基于這種差異,腫

2、瘤新生淋巴管可成為腫瘤診斷與治療中一個新的可行的靶標(biāo)。但由于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(lymphatic endothelial cell,LEC)的取材和培養(yǎng)困難,一直以來對淋巴管生成的研究比較滯后。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞是淋巴管系統(tǒng)最基本的組成單位,是構(gòu)成淋巴管壁的主要結(jié)構(gòu)。它與腫瘤擴散、炎癥等病理過程關(guān)系密切。因此在研究淋巴管發(fā)育和新生的機制以及腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移等病理現(xiàn)象時,對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞尤其是微淋巴管的內(nèi)皮細(xì)胞的研究顯得尤為重要。而成功分離培養(yǎng)

3、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,則可為深入研究腫瘤淋巴管生成提供實驗基礎(chǔ)。
　　 血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-C和VEGF-D是最主要的淋巴管生成因子,它們通過與血管內(nèi)皮生長因子受體3(vascular endothelial growthfactor receptor-3,VEGFR-3)結(jié)合,來促進(jìn)實體瘤內(nèi)淋巴管的新生,并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。研究證實,VEGFR-

4、3表達(dá)于卵巢癌新生淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,這為以VEGFR-3為靶點進(jìn)行卵巢癌淋巴管顯像研究提供了可能。目前顯像研究中所使用的靶向分子探針多為特異性抗體或大分子蛋白,它們分子量大、穿透力差、血液清除慢,T/NT比較低、靶組織分布不均勻等缺點,限制了在臨床的應(yīng)用。與之相比,多肽分子量小、免疫原性低、血液清除快、不會被肝、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)非特異性攝取、合成簡單、易于修飾,是理想的靶向劑。而噬菌體展示肽庫(Phage display peptide li

5、brary)技術(shù)的完善與發(fā)展,也為開發(fā)小分子多肽提供了良好的工具。
　　 在我們的前期研究中通過噬菌體展示技術(shù)篩選獲得了與VEGFR-3胞外區(qū)蛋白結(jié)合的多肽SHSWI-IWLP NLRHYAS。基于以上分析,并結(jié)合前期實驗結(jié)果,本研究擬選擇淋巴管生成作為研究靶點,通過分離培養(yǎng)人微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞來探討該多肽在體外與人微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的VEGFR-3的結(jié)合情況,再利用構(gòu)建的荷人卵巢癌裸鼠模型來觀察多肽靶向腫瘤淋巴管的顯像情況,從

6、面探討以淋巴管生成為靶標(biāo)的分子顯像方法,為深入進(jìn)行卵巢癌淋巴管生成及轉(zhuǎn)移研究提供實驗基礎(chǔ)。
　　 研究目的:通過體外分離培養(yǎng)人微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞來研究多肽SHSWHWLPNLRHYAS在體外與微淋巴管內(nèi)皮特異性結(jié)合及靶向卵巢癌新生淋巴管的分子顯像情況。
　　 研究方法:
　　 1、分離、培養(yǎng)及鑒定人微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。無菌留取無并發(fā)癥及合并癥的行包皮環(huán)切術(shù)的新鮮幼兒包皮,采用組織膠原酶消化和抗體磁珠法分離人淋巴管內(nèi)皮

7、細(xì)胞(human lymphatic capillary endothelial cells,HLECs),并用細(xì)胞克隆柱進(jìn)行純化。通過倒置顯微鏡和透射電鏡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察。間接免疫熒光實驗進(jìn)行細(xì)胞的抗體表型鑒定。MTT法記錄細(xì)胞的生長周期以及VEGF-C對細(xì)胞增殖的影響。
　　 2、VEGFR-3結(jié)合肽在體外與微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合實驗。設(shè)立多肽實驗組、VEFGR-3單抗陽性對照組、PBS陰性對照組,通過間接免疫熒光實驗來檢測

8、多肽與體外培養(yǎng)的微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上特異性表達(dá)的VEGFR-3的結(jié)合情況。
　　 3、VEGFR-3結(jié)合肽在荷卵巢癌裸鼠體內(nèi)靶向新生淋巴管的顯像研究。腫瘤細(xì)胞SKOV3懸液經(jīng)皮下注射法建立荷人卵巢癌裸鼠模型,等腫瘤長至1.0cm3時進(jìn)行實驗。用傳統(tǒng)固相法合成多肽,再進(jìn)行放射性核素99mTc標(biāo)記,紙層析法測定標(biāo)記率。實驗組鼠尾靜脈注射100ul99mTc標(biāo)記多肽(約3700 KBq99mTc/100μg多肽),對照組注射100ul游

9、離99mTc(約3700 KBq),用0.1％戊巴比妥鈉麻醉后,在Spect儀下觀察腫瘤顯像情況。將實驗組15只荷瘤鼠隨機分為3組,分別在注射99mTc-多肽后1h、3h和6h脫頸椎處死一組小鼠,并取眼球后血、心、肺、肝、脾、腎、胃、腸、后大腿骨骼、肌肉和腫瘤組織,稱濕重,用丫放射免疫計數(shù)器測定各組織的放射性計數(shù),計算每克組織百分劑量率(％ID/g)和T/NT。比值。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、原代細(xì)胞培養(yǎng)12-24h

10、后,大部分細(xì)胞已經(jīng)貼壁,有聚集生長的特點,形成由數(shù)個細(xì)胞組成的細(xì)胞群。倒置顯微鏡下見淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平的卵圓形、短梭形或多角形,大小均勻。胞核清晰,有核的區(qū)域較無核區(qū)域突出。呈特征性“鵝卵石狀”或“鋪路石狀”鑲嵌排列生長,并有接觸抑制現(xiàn)象。透射電鏡下可見,細(xì)胞表面伸出大量的短指狀突起,胞漿豐富。有的細(xì)胞內(nèi)含有體積較大的空泡。細(xì)胞核大,形態(tài)各異,染色質(zhì)聚集。線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富。HLECs特異性表達(dá)Padoplanin、D2-40、VEG

11、FR-3、LYVE-1抗體。而對于血管內(nèi)皮細(xì)胞(blood endothelial cells,BECs)特異性表達(dá)的Ⅷ因子抗體,HLECs表達(dá)陰性。培養(yǎng)基中添加了VEGF-C的實驗組細(xì)胞生長活力明顯較正常組高。
　　 2、多肽組可見細(xì)胞漿呈綠色熒光,細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。VEGFR-3陽性對照組,可看到細(xì)胞漿為綠色熒光,胞核區(qū)為藍(lán)色熒光。熒光強度與多肽組相似。PBS陰性對照組,僅見細(xì)胞核區(qū)呈現(xiàn)藍(lán)色熒光,細(xì)胞膜及細(xì)胞漿均未見熒光。<

12、br>　　 3、實驗所構(gòu)建裸鼠移植瘤模型成瘤率為100％。多肽的99mTc標(biāo)記率為95.27％,放射化學(xué)純度為96％。實驗組裸鼠尾靜脈注射99mTc標(biāo)記多肽后1h在移植瘤部位和腎臟、肝臟、膀胱開始出現(xiàn)放射性聚集。其中腎臟每克組織百分劑量率最高,肺中最低,腫瘤排在第6位。在注射3 h后,各組織器官的攝取率均達(dá)到最大,其中最高為腎臟,其次為肝臟,腫瘤升至第4位,此時顯像最清晰。4h后腫瘤顯像開始消褪,至6h完全消失。這時腎臟每克組織百分劑

13、量率仍為最高,血液中最低。游離99mTc注射組腫瘤部位始終未見顯像。由此提示,99mTc標(biāo)記多肽主要分布于腫瘤、肝臟及腎臟組織,在體內(nèi)通過腎臟與肝臟代謝,并從血液中快速清除。腫瘤對側(cè)肌肉組織始終呈低放射性分布,提示99mTc標(biāo)記多肽可特異性在腫瘤組織部位聚集是由腫瘤組織中淋巴管內(nèi)皮高表達(dá)的VEGFR-3介導(dǎo)的。T/NT反映腫瘤與非腫瘤組織濃聚標(biāo)記抗體的差異,其值的高低直接影響SPECT顯像效果。肝臟、腎臟的T/NT值始終較低,同樣提示這

14、些組織內(nèi)的放射性計數(shù)較高,這與多肽從腎臟和肝臟代謝有關(guān)。
　　 結(jié)論:分離培養(yǎng)了高純度的人微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,并建立了簡便、實用和穩(wěn)定的細(xì)胞體外培養(yǎng)方法。通過培養(yǎng)的人微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞,證實了多肽SHSWHWLPNLRHYAS在體外能夠與微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞特異性表達(dá)的VEGFR-3結(jié)合,抗原結(jié)合能力強。同時該結(jié)合肽在荷瘤鼠體內(nèi)能夠靶向移植的人卵巢癌的新生淋巴管內(nèi)皮,實現(xiàn)腫瘤淋巴管分子顯像。因此有望成為靶向卵巢癌新生淋巴管的導(dǎo)向劑,為卵