PEI-alginate納米粒轉(zhuǎn)染VEGFR-3 siRNA后抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞淋巴管新生的作用.pdf

1、[目的]研究轉(zhuǎn)運(yùn)載體聚乙烯亞胺-藻酸鹽(PEI-alginate)納米粒轉(zhuǎn)染的VEGFR-3 siRNA靶向抑制人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞淋巴管新生的作用，探討以淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞為靶點(diǎn)抑制腫瘤淋巴新生和淋巴轉(zhuǎn)移的可行性。
　　[方法]用Percoll非連續(xù)密度梯度離心法從胎兒臍帶血中分離出單個(gè)核細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析VEGFR-3+CD34+細(xì)胞和VEGFR-3+CD133+細(xì)胞在單個(gè)核細(xì)胞中所占的百分比。通過流式細(xì)胞儀分選出VEGFR-

2、3+細(xì)胞，然后通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法鑒定VEGFR-3+細(xì)胞表面CD34和CD133的分布及表達(dá)。用VEGF-C誘導(dǎo)細(xì)胞數(shù)目的擴(kuò)增。用水化法制備PEI-alginate納米粒以及包封VEGFR-3 siRNA制成PEI-alginate/siRNA納米復(fù)合物，通過掃描電子顯微鏡及粒度分析儀檢測納米復(fù)合物的表面特征、粒徑及表面電荷。按照人VEGFR-3的基因序列合成3段不同的siRNA，根據(jù)氮磷比(N/P)的不同，制備不同的納米復(fù)合物

3、。通過凝膠電泳阻滯法檢測PEI-alginate納米粒包封VEGFR-3siRNA的效率。用PEI-alginate納米粒轉(zhuǎn)染帶有熒光標(biāo)記的VEGFR-3 siRNA，檢測VEGFR-3 siRNA的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率。MTT法檢測不同N/P比值的納米復(fù)合物對(duì)細(xì)胞的毒性。透射電子顯微鏡檢測用納米復(fù)合物處理細(xì)胞后，納米復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的分布及降解。通過MTT法、增殖細(xì)胞核抗原染色方法、跨膜遷移實(shí)驗(yàn)及Matrigel凝膠內(nèi)毛細(xì)淋巴管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)

4、分別檢測經(jīng)PEI-alginate/siRNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染后淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞的活性、增殖細(xì)胞數(shù)目、遷移細(xì)胞數(shù)目以及毛細(xì)淋巴管樣結(jié)構(gòu)的長度和面積的變化。
　　[結(jié)果]經(jīng)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果VEGFR-3+CD34+細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的0.7％,VEGFR-3+CD133+細(xì)胞占單個(gè)核細(xì)胞的0.49％。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示在VEGFR-3+細(xì)胞的細(xì)胞膜上有CD34和CD133的表達(dá)。剛分離的單個(gè)核細(xì)胞成圓形或橢圓形，經(jīng)VEGF-C誘導(dǎo)3

5、天后，大部分細(xì)胞開始伸出偽足，細(xì)胞呈梭形或多邊形，誘導(dǎo)7天后，細(xì)胞成簇分布，細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞量增多，體積增大。水化法制備的PEI-alginate納米粒經(jīng)粒度分析儀及掃描電鏡檢測其粒徑及電荷均符合納米粒載體的基本條件。納米粒轉(zhuǎn)染效率約84％。隨著納米粒轉(zhuǎn)染載體中PEI量的增加，納米粒所攜帶的VEGFR-3 siRNA的量增多。當(dāng)N/P增至8時(shí)，溶液中的VEGFR-3 siRNA幾乎完全與PEI-alginate納米粒結(jié)合形成PEI-a

6、lginate/siRNA納米復(fù)合物。用不同N/P比值的納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞的活性逐漸降低，當(dāng)N/P=16時(shí)，細(xì)胞活性與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考慮N/P為16為合適比例，以此比例制備的納米復(fù)合物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將制備的納米粒復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，透射電鏡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染2h后，納米復(fù)合物主要結(jié)合在細(xì)胞膜表面或剛進(jìn)入細(xì)胞質(zhì);轉(zhuǎn)染4h時(shí)，大部分的復(fù)合物已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，小部分納米粒開始降解;轉(zhuǎn)染6h時(shí)，大部分納米復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)中降解為較小的

7、顆粒。根據(jù)目的基因合成的不同VEGFR-3 siRNA與PEI-alginate納米粒制備成納米復(fù)合物，然后用這些不同的納米粒復(fù)合物轉(zhuǎn)染LEPCs，RT-PCR結(jié)果顯示用第1段siRNA制備的納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染LEPCs后VEGFR-3 mRNA的表達(dá)最低，所以選此納米復(fù)合物進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。用藻酸鹽修飾的PEI納米粒處理細(xì)胞，細(xì)胞活性明顯高于未經(jīng)修飾的PEI。跨膜遷移結(jié)果顯示納米粒經(jīng)siRNA干擾的細(xì)胞遷移能力減弱。增殖細(xì)胞核抗原染色結(jié)果發(fā)

8、現(xiàn)經(jīng)納米粒處理的細(xì)胞熒光強(qiáng)度減弱。Matrigel凝膠內(nèi)毛細(xì)淋巴管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)顯示VEGF-C組毛細(xì)淋巴管樣結(jié)構(gòu)的長度及面積明顯高于對(duì)照組，而VEGFR-3 siRNA抑制后毛細(xì)淋巴管樣結(jié)構(gòu)長度和面積明顯小于VEGF-C組。
　　[結(jié)論]PEI-alginate納米粒作為VEGFR-3 siRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可將VEGFR-3siRNA高效的轉(zhuǎn)入LEPCs。經(jīng)PEI-alginate/siRNA納米復(fù)合物轉(zhuǎn)染的LEPCs活性和遷