金復(fù)康口服液抑制淋巴管新生及機(jī)制研究.pdf

1、目的:淋巴管新生與腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞參與淋巴管新生的過(guò)程，目前已經(jīng)明確VEGF-C/VEGFR-3信號(hào)途徑在淋巴管新生中起著重要作用，而SDF-1/CXCR4信號(hào)途徑是否參與淋巴管新生的過(guò)程尚未明確;金復(fù)康口服液具有良好的抗腫瘤功效，已經(jīng)被證實(shí)具有抑制血管新生的作用。本實(shí)驗(yàn)將研究VEGF-C/VEGFR-3及/或SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸對(duì)淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及趨化遷移作用，探討金復(fù)康口服液抑制淋巴管新生的

2、機(jī)制。
　　方法:運(yùn)用血清藥理學(xué)方法，口服給予大鼠金復(fù)康口服液:金復(fù)康低劑量組（5.4g/kg·d）、金復(fù)康中劑量組(10.8g/kg·d)、金復(fù)康高劑量組(21.6g/kg·d)，制備大鼠金復(fù)康口服液含藥血清;收集新鮮無(wú)菌正常足月娩出胎兒的臍帶血，采用密度梯度法分離人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞;流式細(xì)胞儀分選人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞中的CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞;用含20％FBS的EGM-2MV培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中分別加入不同的細(xì)胞因

3、子及金復(fù)康口服液含藥血清，觀察細(xì)胞增殖、分化及遷移能力的變化，具體方法如下:
　　1.培養(yǎng)基中加入60ng/ml VEGF-C，并分為5個(gè)組:①空白血清作為陰性對(duì)照;②金復(fù)康低劑量含藥血清組;③金復(fù)康中劑量含藥血清組;④金復(fù)康高劑量含藥血清組;⑤陽(yáng)性對(duì)照組:給予VEGFR-3的抑制劑Lenvatinib(E7080)。CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞培養(yǎng)1周后，用Transwell小室觀察細(xì)胞趨化遷移能力的變化;2周后，采用MTT

4、試驗(yàn)觀察細(xì)胞的增殖情況，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞誘導(dǎo)分化后淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)YVE-1的表達(dá)情況，并利用透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)。
　　2.培養(yǎng)基中加入100ng/ml SDF-1，并分為5個(gè)組，方法同上，其中陽(yáng)性對(duì)照組給予CXCR4的抑制劑AMD3100;最后分別觀察細(xì)胞的趨化遷移能力及LYVE-1的表達(dá)情況，方法同上。
　　3.培養(yǎng)基中加入60ng/ml VEGF-C和100ng/ml SDF-1，并分為5個(gè)組，方法同

5、上，其中陽(yáng)性對(duì)照組給予E7080和AMD3100;最后分別觀察細(xì)胞的趨化遷移能力及LYVE-1的表達(dá)情況，方法同上。
　　結(jié)果:1.VEGF-C誘導(dǎo)人臍帶血CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞分化后表達(dá)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)YVE-1，細(xì)胞胞核較大，胞質(zhì)內(nèi)含有較多的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及吞飲小泡，并可見(jiàn)Weibel-Palade小體，提示CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞經(jīng)VEGF-C誘導(dǎo)后能夠分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。金復(fù)康口服液含藥血清能

6、夠抑制LYVE-1的表達(dá)(P＜0.01)，表明金復(fù)康口服液含藥血清能夠調(diào)控VEGF-C/VEGFR-3反應(yīng)軸抑制CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化。MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同劑量的金復(fù)康含藥血清對(duì)細(xì)胞的增殖并無(wú)抑制作用。趨化遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在VEGF-C的趨化作用下，人臍帶血CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞從Transwell上室內(nèi)穿過(guò)聚碳酯膜向膜下遷移，并且，與空白血清組相比較，經(jīng)不同濃度的金復(fù)康口服液含藥血清預(yù)處理的細(xì)胞均表

7、現(xiàn)為向下室遷移能力的減弱(P＜0.05)。
　　2.SDF-1誘導(dǎo)人臍帶血CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞分化后表達(dá)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)YVE-1，表明經(jīng)SDF-1誘導(dǎo)后CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞能夠分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞。金復(fù)康口服液含藥血清能夠抑制LYVE-1的表達(dá)(P＜0.01)，表明金復(fù)康口服液含藥血清能夠調(diào)控SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸來(lái)抑制CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞分化。趨化遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在

8、SDF-1的趨化作用下，人臍帶血CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞從Transwell上室內(nèi)穿過(guò)聚碳酯膜向膜下遷移，并且，與空白血清組相比較，經(jīng)不同濃度的金復(fù)康口服液含藥血清預(yù)處理的細(xì)胞均表現(xiàn)為向下室遷移能力的減弱(P＜0.05)。
　　3.在VEGF-C和SDF-1的共同誘導(dǎo)作用下，人臍帶血CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)2周分化后采用免疫熒光法檢測(cè)到細(xì)胞表達(dá)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物L(fēng)YVE-1，金復(fù)康口服液含藥血清能夠抑制LY

9、VE-1的表達(dá)(P＜0.01);并且與單純采用VEGF-C或SDF-1誘導(dǎo)相比，在二者共同誘導(dǎo)作用下細(xì)胞LYVE-1的熒光表達(dá)更強(qiáng)(P＜0.01)，表明VEGF-C和SDF-1在誘導(dǎo)CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程中存在協(xié)同作用。細(xì)胞趨化遷移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與單純VEGF-C或SDF-1趨化相比較，在VEGF-C和SDF-1的共同趨化作用下人臍帶血CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞表現(xiàn)為向下室遷移能力的顯著增強(qiáng)(P＜0

10、.01)。
　　結(jié)論:人臍帶血CD34+/VEGFR-3+內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)VEGF-C或SDF-1誘導(dǎo)后能夠分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，VEGF-C/VEGFR-3和SDF-1/CXCR4兩個(gè)反應(yīng)軸之間在誘導(dǎo)CD34+/VEGFR-3+細(xì)胞分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的過(guò)程中存在協(xié)同作用;金復(fù)康口服液通過(guò)抑制VEGF-C/VEGFR-3和SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸的活化抑制臍帶血淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和定向遷移的能力，這可能是其抑