炎性介質(zhì)IL-1β和IL-3調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)淋巴管表型的作用.pdf

1、研究背景:淋巴管是心血管循環(huán)系統(tǒng)的重要輔助系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及免疫、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。淋巴管新生（lymphangiogenesis）與機(jī)體組織許多病理生理過程密切相關(guān)，尤其是在炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)以及腫瘤轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。因此，探尋淋巴管新生機(jī)制對于上述疾病的治療具有重要意義。
　　 以往的研究認(rèn)為，淋巴管新生的途徑主要有兩個(gè)方面:原有的淋巴管在血管內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)的作用下以出芽方

2、式形成新的淋巴管;外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移到局部組織，在VEGF-C等的誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞(lymphaticendothelialcells，LECs)。近期的研究發(fā)現(xiàn)，許多炎性介質(zhì)與淋巴管標(biāo)志物（Prox-1、Podoplanin、VEGFR-3、LYVE-1等）的表達(dá)和淋巴管新生有密切聯(lián)系，例如:LPS、TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-3、IL-6等。然而，炎性介質(zhì)調(diào)節(jié)淋巴管內(nèi)皮表型的作用機(jī)制尚不十分清楚。
　

3、　 文獻(xiàn)報(bào)道，炎性介質(zhì)LPS、IL-3等能刺激內(nèi)皮細(xì)胞的NF-KB的P50同源二聚體途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞淋巴管標(biāo)志物的表達(dá);另有文獻(xiàn)認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞(bloodendothelialcells，BECs)在炎性介質(zhì)IFN-γ、TNF-α的作用下表達(dá)IL-3，間接通過IL-3刺激淋巴管標(biāo)志物的表達(dá)。IL-1是許多病理過程中重要的炎性因子，能否通過NF-KB途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)淋巴管表型即向淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化？尚未見報(bào)道。本文重點(diǎn)研究了I

4、L-1β、IL-3誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)采用炎性介質(zhì)IL-1β和IL-3分別處理分離培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-1730，研究誘導(dǎo)或維持內(nèi)皮細(xì)胞的淋巴管內(nèi)皮表型特性的關(guān)鍵因素。
　　 方法:①取臍帶，按常規(guī)分離培養(yǎng)原代HUVECs，細(xì)胞融合后觀察并記錄其形態(tài)，用vWF

5、相關(guān)抗原的免疫細(xì)胞化學(xué)染色驗(yàn)證是否為BECs，傳代進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-1730，按同樣條件培養(yǎng)。②采用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HUVECs和CRL-1730細(xì)胞株對淋巴管標(biāo)志物Prox-1、VEGFR-3、Podoplanin、LYVE-1的表達(dá)情況。③分別用IL-1β或IL-3刺激CRL-1730細(xì)胞株一定時(shí)間，觀察刺激前后細(xì)胞形態(tài)的改變;采用RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞對淋巴管標(biāo)志物的表達(dá)情況。

6、④采用Real-timePCR法檢測CRL-1730細(xì)胞株經(jīng)IL-1β刺激前、后對淋巴管標(biāo)志物mRNA表達(dá)量的差異。⑤將NF-κB阻斷劑PDTC加入到培養(yǎng)的CRL-1730細(xì)胞株中，1h后再加入IL-1β刺激一定時(shí)間后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測細(xì)胞NF-κB活性改變，并用RT-PCR法檢測CRL-1730細(xì)胞株對淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:①RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法發(fā)現(xiàn):分離培養(yǎng)的HUVECs表達(dá)淋巴管標(biāo)志物，而

7、CRL-1730細(xì)胞株則不表達(dá)淋巴管標(biāo)志物。②CRL-1730細(xì)胞株經(jīng)IL-1β或IL-3刺激24h后，生長匯合的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)由鵝卵石狀變?yōu)殚L梭形;RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)法證實(shí)表達(dá)淋巴管標(biāo)志物。③Real-timePCR檢測結(jié)果顯示:與未經(jīng)刺激的分離培養(yǎng)的HUVECs相比，未經(jīng)刺激的內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-1730對淋巴管內(nèi)皮標(biāo)志物Prox-1、Podoplanin、VEGFR-3、LYVE-1的mRNA表達(dá)量極少;經(jīng)IL-1β刺激1.5

8、h后表達(dá)量顯著升高（表1，圖10），P＜0.05。進(jìn)一步驗(yàn)證了之前刺激實(shí)驗(yàn)做出的RT-PCR結(jié)果。④CRL-1730細(xì)胞株在加入NF-κB阻斷劑PDTC之后再用炎性因子IL-1β刺激，免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR法檢測其呈陰性表達(dá)。
　　 結(jié)論:IL-1β和IL-3均能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)淋巴管內(nèi)皮表型;IL-1β能通過NF-κB途徑誘導(dǎo)BECs表達(dá)淋巴管內(nèi)皮表型。
　　 意義:研究炎性介質(zhì)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮轉(zhuǎn)分化為淋巴管內(nèi)皮細(xì)