IL-7-IL-7R促進(jìn)肺癌淋巴管形成和轉(zhuǎn)移的機(jī)制.pdf

1、白介素—7(Interleukin—7，IL—7)是一種能誘發(fā)造血細(xì)胞和惡性腫瘤發(fā)生和增殖的細(xì)胞因子，在乳腺癌細(xì)胞系IL—7通過(guò)磷脂酰肌醇—3—激酶(phosphatidylinositol3—kinase，PI3K)敏感徑路誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，這對(duì)研究乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展有著重要意義。卵巢癌可刺激宿主免疫細(xì)胞分泌IL—7，血清和腹腔液IL—7升高是宿主免疫系統(tǒng)抗腫瘤作用的一種表現(xiàn)。IL—7作為一種具有潛在抗腫瘤作用的免疫調(diào)節(jié)活性因子，

2、其在腹水中水平升高不及血清顯著，推測(cè)腹腔局部可能存在某些免疫抑制因素。提高腹腔局部IL—7水平可對(duì)卵巢癌有治療意義。目前IL—7在腫瘤中的作用不一，作用機(jī)制也不清楚。 目的： 本研究探討IL—7在肺癌中的表達(dá)，分析它們與各臨床病理因素之間的關(guān)系，揭示IL—7在肺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用機(jī)制。 驗(yàn)材料和方法： 一、材料 100例原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌癌組織及癌旁正常肺組織標(biāo)本均來(lái)自1980年到200

3、5年在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬一院實(shí)行手術(shù)的病人，患者術(shù)前均未接受放化療。標(biāo)本用中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，制成4μm切片，采用鏈霉素抗生物素蛋白—過(guò)氧化物酶免疫組化法(streptavidin-Peroxidase，S-P法)檢測(cè)組織中IL—7、IL—7R和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子—D(vascular endothelial growth factor—D，VEGF—D)蛋白表達(dá)情況，微血管密度(microvessel density，MVD)

4、和淋巴管密度(lymphatic vessel density，LVD)。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：IL—7、IL—7R和VEGF—D以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性顯色。光鏡下每張切片選取癌細(xì)胞較多的10個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，IL—7、IL—7R(Interleukin—7Receptor)和VEGF—D的評(píng)估為：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為“—”，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5％為“+”，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為5％—20％為“++”，>20

5、％為“+++”，其中“++”和“+++”為高表達(dá)，“—”和“+”為低表達(dá)。血管和淋巴管判定標(biāo)準(zhǔn)為：內(nèi)皮細(xì)胞形成條狀、裂隙狀等孤立結(jié)構(gòu)棕黃染色或有管腔者按一條血管或淋巴管計(jì)數(shù)。低倍光鏡下確定3個(gè)微血管或淋巴管高密度區(qū)域(熱點(diǎn))，然后在高倍鏡下分別計(jì)數(shù)每個(gè)熱點(diǎn)中3個(gè)區(qū)域的CD34染色(用于標(biāo)記MVD)和D2—40(用于標(biāo)記LVD)染色陽(yáng)性管腔數(shù)均值。MVD=(CD34陽(yáng)性管腔數(shù)—D2—40陽(yáng)性管腔數(shù))均值；LVD=D2—40陽(yáng)性管腔數(shù)均值。

6、當(dāng)計(jì)數(shù)相差10％以上時(shí)則重新計(jì)數(shù)。 二、細(xì)胞培養(yǎng) 分別用含10％新鮮胎牛血清的RPMI1640或DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞系PG—LH7和NCI—H460、人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和SPC—A1和人肺鱗癌細(xì)胞系SK—MES—1。 三、逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR) 提取細(xì)胞總RNA，按RT-PCR(TaKaRa)試劑盒方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μL，取4

7、μL的RT產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20μL。PCR引物經(jīng)在GeneBank上比對(duì)后在bio—spring公司合成。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。 四、Western Blot法 在收集的細(xì)胞內(nèi)加入裂解液充分裂解，低溫高速離心(4℃，12000轉(zhuǎn)/min，30min)，提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳(12％SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印(50V，120min)、5％

8、正常小牛血清封閉，一抗c—Jun(1：200)、phosphorylated—c—Jun(p—c—Jun，1：200)、c—Fos(1：200)、VEGF(1：200)、VEGF—D(1：200)和β—actin(1：200)，抗體均購(gòu)自Santa Cruz，USA，4℃孵育過(guò)夜，分別與各自對(duì)應(yīng)的二抗(1：2500，chemicon，USA)室溫孵育2h，3，3’—二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀(Chemi I

9、mager5500，Alpha Innotech，USA)采集，進(jìn)行灰度值測(cè)定。 五、染色質(zhì)免疫沉淀法 加入37％的甲醛使A549細(xì)胞內(nèi)的蛋白和DNA充分交聯(lián)，裂解細(xì)胞，超聲剪切DNA片段(80w，30次)，免疫沉淀交聯(lián)的蛋白和DNA，洗脫蛋白/DNA復(fù)合物，逆轉(zhuǎn)蛋白/DNA復(fù)合物交聯(lián)，純化DNA，做PCR，重復(fù)三次，取平均值。 六、免疫共沉淀法 在收集的新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞中加入裂解液，充分裂解后，每管分別加

10、入100ul磁珠(Miltenyi Biotec，Germany)和20ul c—Jun抗體，使終體積為1ml，4℃孵育30min，用蛋白裂解液沖洗u柱(Miltenyi Biotec，Germany)，將蛋白樣加入u柱，加入20ul的95℃預(yù)熱上樣緩沖液，孵育5min，用50ul的95℃預(yù)熱上樣緩沖液沖洗，收集液體，做Western blot，重復(fù)三次，取平均值。 七、細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè) 在transwell小室(

11、Coming公司)下室加入600ul含10％小牛血清DMEM培養(yǎng)基，上室中加入100ul無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，接種A549細(xì)胞數(shù)為2.5×104個(gè)。37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)6hr后吸盡培養(yǎng)基，PBS清洗后，甲醇室溫固定15min，用棉簽輕擦掉微孔膜上表面的細(xì)胞，蘇木素染色，室溫干燥過(guò)夜。取下微孔膜，置載玻片上，鏡下觀察。細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定用預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)基以1：7稀釋Matrigel(BD Biosciences，USA)加入上室

12、100ul，在室溫下放置6h。使用前用培養(yǎng)基重新水化并吸凈，其他與遷移實(shí)驗(yàn)相同，培養(yǎng)18hr后觀察結(jié)果。 八、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔含103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24h，每孔加入MTT(Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium bromide)溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h，加入DMSO，490nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光吸收值，以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作對(duì)照。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

13、 九、體內(nèi)裸鼠移植實(shí)驗(yàn) 將24只4周齡裸鼠背部皮下注射A549細(xì)胞(2×107個(gè)/只)，1周后(有腫瘤形成)隨機(jī)分成4組，每組6只。以后每周1次，每次50ul背部皮下注射。一組：注射PBS；二組注射IL—7(20mg/ml)；三組注射IL—7(20mg/ml)+IL—7R(50mg/ml)；四組注射IL—7R(50mg/ml)。10周后處死。觀察瘤大小，并取瘤組織檢測(cè)其他指標(biāo)。 十、數(shù)據(jù)分析 使用SPSS13

14、.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、IL—7/IL—7R高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良正相關(guān)，與VEGF—D的表達(dá)正相關(guān)，IL—7/IL—7R和VEGF—D高表達(dá)組腫瘤中的LVD明顯高于低表達(dá)組。 2、在肺癌IL—7R+細(xì)胞中IL—7通過(guò)IL—7R調(diào)控AP—1復(fù)合物中c—fos，c—Jun表達(dá)及磷酸化，促進(jìn)c—fos和c—Jun形成異二聚體，并與VEGF—D基因