腫瘤干細(xì)胞促卵巢癌淋巴管生成及轉(zhuǎn)移的作用及機制研究.pdf

1、卵巢癌為女性常見惡性腫瘤,死亡率居婦科惡性腫瘤首位,卵巢癌的侵襲性生長與轉(zhuǎn)移是其預(yù)后不良的主要原因。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中的脈管生成在腫瘤侵潤生長與轉(zhuǎn)移中扮演重要角色,但一直以來關(guān)于腫瘤脈管生成的研究主要集中在血管方面,對淋巴管的研究較少。臨床觀察發(fā)現(xiàn)高淋巴管密度與卵巢癌腹膜轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),淋巴管生成在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移起了重要作用。隨著淋巴管特異性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)和淋巴管生成調(diào)控因子研究的深入,淋巴管生成對腫瘤侵襲

2、轉(zhuǎn)移的重要性逐漸得以認(rèn)識,但其機制尚未明確。
　　近年來,腫瘤干細(xì)胞理論研究結(jié)果顯示腫瘤組織內(nèi)存在著極少數(shù)能自我更新、多向分化、高致瘤性的腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。對卵巢癌的研究有類似發(fā)現(xiàn),卵巢癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移與其體內(nèi)存在的數(shù)量極少的腫瘤干細(xì)胞相關(guān)。而腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移除腫瘤細(xì)胞自身的生物學(xué)行為以外,尚有血管、淋巴管生成以提供養(yǎng)料,同時腫瘤組織的脈管生成在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起重要作用。因此,研究腫瘤干細(xì)胞與淋

3、巴管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用,以探索腫瘤干細(xì)胞在卵巢癌淋巴轉(zhuǎn)移中的作用有重要意義。另外,腫瘤干細(xì)胞通過何種機制參與卵巢癌的淋巴轉(zhuǎn)移?目前研究的熱點集中在SDF-1/CXCR4信號軸,SDF-1/CXCR4信號軸參與體內(nèi)多種生理、病理過程,與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。新近的研究還發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4軸與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。卵巢癌患者腹水中檢測到高水平SDF-1,卵巢癌組織高表達(dá)CXCR4,SDF-1在淋巴組織中高表達(dá),高表達(dá)CXCR

4、4的腫瘤細(xì)胞受SDF-1的趨化作用而發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移。然而SDF-1在卵巢癌干細(xì)胞與淋巴管生成中的作用尚未見報道,需進(jìn)一步研究。
　　卵巢癌的淋巴管生成和轉(zhuǎn)移除了腫瘤干細(xì)胞的參與外,循環(huán)中淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞是否具有同樣重要作用尚不清楚。實驗已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外周血中骨髓來源的淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞參與了淋巴管新生,新近研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤患者出現(xiàn)外周血淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞增多,淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞被動員參與腫瘤淋巴管生成。淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞參與淋巴管新生的機制極其復(fù)雜

5、,涉及動員、趨化遷移、分化等多個環(huán)節(jié),目前僅認(rèn)為VEGF-C/VEGFR-3信號途徑在其中起著重要的調(diào)控作用,具體機制尚不清。
　　在本研究中,首先,我們采用無血清懸浮培養(yǎng)法富集卵巢癌A2780細(xì)胞系中的細(xì)胞球,以CD133作為標(biāo)記分子,用流式細(xì)胞儀從細(xì)胞球中分選出CD133+細(xì)胞,通過對CD133+自我更新、多向分化、致瘤性、干細(xì)胞標(biāo)志基因等多種生物學(xué)特征進(jìn)行檢測,其生物學(xué)行為具備目前腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特點,鑒定其為卵巢癌干細(xì)胞

6、,為后續(xù)實驗展開打下基礎(chǔ)。然后,我們利用Transwell小室對CD133+細(xì)胞和本課題組前期建株的人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),觀察共培養(yǎng)時兩種細(xì)胞的相互作用。一方面觀察共培養(yǎng)對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響,用酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測上清液中細(xì)胞因子VEGF-C的濃度,同時觀察共培養(yǎng)對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響,用RayBio?人細(xì)胞因子抗體芯片對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上清液進(jìn)行細(xì)胞因子芯片篩查,對其中差異表達(dá)的趨化因子SDF-1用酶聯(lián)免疫吸附實驗進(jìn)行驗證,

7、并進(jìn)一步觀察了上調(diào)和下調(diào)SDF-1對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。另一方面我們用WB檢測了CD133+細(xì)胞CXCR4蛋白的表達(dá),觀察了共培養(yǎng)對卵巢癌CD133+細(xì)胞侵襲的影響,以及共培養(yǎng)后卵巢癌CD133+細(xì)胞VEGF的表達(dá)。與此同時我們用流式細(xì)胞儀檢測了卵巢癌患者外周血中淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞/CD34+VEGFR3+細(xì)胞的含量,酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測了患者外周血中VEGF-C、SDF-1的濃度,對淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞和患者臨床資料進(jìn)行相關(guān)性分析,并

8、對淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞與外周血VEGF-C、SDF-1的濃度進(jìn)行了相關(guān)性分析。主要的結(jié)果和結(jié)論如下:
　　1、卵巢癌A2780細(xì)胞系中存在極少量的CD133+細(xì)胞,可通過懸浮條件培養(yǎng)法富集,流式細(xì)胞儀分選得到CD133+細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)方法簡單,重復(fù)性強,CD133+細(xì)胞比例穩(wěn)定在0.2％左右。卵巢癌CD133+細(xì)胞能自我更新、多向分化,致瘤性強,多種干細(xì)胞標(biāo)志基因高表達(dá),符合腫瘤干細(xì)胞的特征。CD133是其特異性表面標(biāo)志,能用于后續(xù)卵

9、巢癌干細(xì)胞研究中干細(xì)胞的分選和鑒定。
　　2、卵巢癌干細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和卵巢癌干細(xì)胞生長均產(chǎn)生作用。觀察發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)時淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖增加,ELISA檢測共培養(yǎng)上清液VEGF-C含量明顯升高。共培養(yǎng)時時淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移增加,其共培養(yǎng)上清液中出現(xiàn)多種細(xì)胞因子差異表達(dá),39種細(xì)胞因子上調(diào),5種細(xì)胞因子下調(diào),ELISA檢測驗證上清液中上清液SDF-1含量明顯升高,在上調(diào)和下調(diào)了SDF-1的共培養(yǎng)體系中,SDF

10、-1對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移產(chǎn)生影響,100ng/mlSDF-1促進(jìn)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用明顯,而拮抗劑AMD3100在75ug/ml則明顯抑制淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。觀察還發(fā)現(xiàn)卵巢癌干細(xì)胞CXCR4高表達(dá),卵巢癌干細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時卵巢癌CD133+細(xì)胞侵襲能力增加,WB結(jié)果顯示共培養(yǎng)后卵巢癌干細(xì)胞VEGF表達(dá)上調(diào)。
　　3、卵巢癌患者外周血中淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞含量升高,與患者腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)。同時卵巢癌患者外周

11、血中SDF-1和VEGF-C水平明顯升高,淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞水平升高與SDF-1升高有相關(guān)性。
　　綜上所述,CD133是卵巢癌A2780干細(xì)胞的特異標(biāo)志因子,卵巢癌干細(xì)胞可用懸浮培養(yǎng)結(jié)合流式細(xì)胞儀分離。卵巢癌干細(xì)胞與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)時兩細(xì)胞生長互相作用,共培養(yǎng)時淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖遷移增加,卵巢癌干細(xì)胞侵襲能力加強。SDF-1/CXCR4信號軸參與了其中的調(diào)控。卵巢癌患者外周血淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞升高,淋巴管內(nèi)皮祖細(xì)胞與腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移