CFTR在上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究.pdf

1、卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。在卵巢癌中，最為常見的病理類型是上皮性卵巢癌。在發(fā)達(dá)國(guó)家，上皮性卵巢癌是致死率最高的婦科腫瘤，超過70％的婦女在被診斷時(shí)就已經(jīng)是晚期，而晚期卵巢癌的治愈率不高于30%。上皮性卵巢癌的治療效果不佳，與其在診斷之前腫瘤的早期侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。到目前為止，上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍然不完全清楚。所以尋找上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)志物，研究其轉(zhuǎn)移機(jī)制，一直是卵巢癌研究中的熱點(diǎn)。
　　囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)

2、因子（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR）是一個(gè)約170 kDa的糖蛋白，是一個(gè)環(huán)磷酸腺苷依賴的氯離子通道蛋白。CFTR分布于人類各組織的上皮細(xì)胞，包括女性生殖道，通過調(diào)控離子和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，在維持和穩(wěn)定機(jī)體局部液體微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。CFTR是ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，它們利用ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)底物通過細(xì)胞膜，這與多

3、種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。CFTR的基因突變可以導(dǎo)致其在細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)功能的障礙，可能增加或減少一些惡性腫瘤患病風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤類型不同，CFTR能夠促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生。還有研究表明，CFTR與乳腺癌的上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。CFTR也與一些細(xì)胞炎癥和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)。國(guó)內(nèi)外目前尚無(wú)CFTR在上皮性卵巢癌惡性生物學(xué)行為中的相關(guān)研究報(bào)道。因此，本課題將分為以下三部分對(duì)CFTR在上皮性卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其潛在的機(jī)制進(jìn)行初步研究。

4、>　　第一部分.CFTR在人上皮性卵巢癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性
　　目的:檢測(cè)人上皮性卵巢癌組織、良性卵巢組織及正常卵巢組織標(biāo)本中CFTR的蛋白表達(dá)情況，探討上皮性卵巢癌組織中CFTR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　方法:
　　（1）采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CFTR在83例上皮性卵巢癌組織標(biāo)本，18例良性腫瘤標(biāo)本和11例正常卵巢組織標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　（2）分析CFTR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間

5、的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，CFTR在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)比良性卵巢腫瘤組（P<0.05）以及正常卵巢組（P<0.05）均明顯增高，異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而良性卵巢腫瘤和正常卵巢組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在上皮性卵巢癌中，CFTR蛋白的表達(dá)水平在FIGOⅢ/Ⅳ期組織中顯著高于Ⅰ/Ⅱ期（P<0.05)，病理分級(jí)2-3級(jí)組織中的表達(dá)顯著高于1級(jí)（P<0.05)，血漿Ca-125>35U/ml的組織

6、中表達(dá)顯著高于Ca-125<35U/ml的組織（P<0.05)，但與患者年齡、腫瘤大小、血漿HE4水平無(wú)關(guān)(P>0.05)。在各個(gè)病理類型中，漿液性囊腺癌中CFTR的表達(dá)水平比粘液性囊腺癌（P<0.05）和子宮內(nèi)膜樣癌（P<0.05）高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:在上皮性卵巢癌組織中CFTR高表達(dá)。高水平的CFTR與上皮性卵巢癌分期、腫瘤分化、血漿Ca-125值有關(guān)，CFTR的高表達(dá)可能與臨床不良預(yù)后有關(guān)。在卵巢漿液性囊腺癌

7、組織中，CFTR的表達(dá)水平比其他病理類型高，這可能說(shuō)明 CFTR在漿液性囊腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　第二部分.CFTR基因特異性shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細(xì)胞株的篩選及人CFTR基因重組腺病毒的包裝及鑒定
　　目的:應(yīng)用人CFTR基因特異性短發(fā)卡RNA（shRNA）真核質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞，嘌呤霉素篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的卵巢癌細(xì)胞株，并檢測(cè)驗(yàn)證。構(gòu)建包含人CFTR基因的重組腺病毒真核表達(dá)載體，使用HEK293

8、細(xì)胞包裝重組腺病毒。利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株和重組腺病毒，為后續(xù)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌法擴(kuò)增CFTR基因特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒，并酶切鑒定。將shRNA質(zhì)粒通過PolyJet?轉(zhuǎn)染到A2780、SKOV3細(xì)胞中，對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進(jìn)行嘌呤霉素加壓篩選，熒光顯微鏡觀察后，挑選克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，直至建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。采用Western blot法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CFTR蛋白表達(dá)量的變化，驗(yàn)

9、證和篩選CFTR基因抑制效應(yīng)最顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　將目的片段人CFTR基因酶切、分離、純化。構(gòu)建pAdTrace-CFTR-TOX載體并酶切及測(cè)序鑒定。利用BJ5183細(xì)菌行質(zhì)粒pAdTrace-CFTR的同源重組，然后酶切及PCR法鑒定。將同源重組質(zhì)粒pAdTrace-CFTR線性化后轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，進(jìn)行病毒的包裝和擴(kuò)增，乒乓感染法制備高滴度Ad-CFTR腺病毒，熒光顯微鏡觀察。行Western blot檢測(cè)病毒感

10、染后卵巢癌細(xì)胞CFTR蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：經(jīng)酶切驗(yàn)證，成功擴(kuò)增CFTR特異性shRNA表達(dá)質(zhì)粒。將CFTR-shRNA-1, CFTR-shRNA-2, CFTR-shRNA-3, CFTR-shRNA-4和陰性對(duì)照成功轉(zhuǎn)染A2780、SKOV3細(xì)胞，嘌呤霉素霉素加壓篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞克隆的GFP表達(dá)，成功驗(yàn)證和篩選有均勻GFP熒光的細(xì)胞克隆。通過Western blot法檢測(cè)CFTR蛋白表達(dá)

11、，驗(yàn)證和篩選CFTR基因抑制效果最顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細(xì)胞株A2780-CFTRi2和SKOV3-CFTRi3細(xì)胞。
　　經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳鑒定表明目的人CFTR基因分離成功。經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳及基因測(cè)序表明重組質(zhì)粒pAdTrace-CFTR-TOX構(gòu)建成功。經(jīng)酶切后瓊脂糖電泳、PCR檢測(cè)表明同源重組質(zhì)粒pAdTrace-CFTR構(gòu)建成功。熒光顯微鏡觀察，HEK293細(xì)胞RFP表達(dá)，表明Ad-CFTR腺病毒包裝及擴(kuò)增成功。熒

12、光顯微鏡觀察Ad-CFTR腺病毒感染卵巢癌細(xì)胞效率，western blot分析表明腺病毒Ad-CFTR感染后細(xì)胞CFTR蛋白表達(dá)增加，說(shuō)明重組腺病毒Ad-CFTR構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:成功擴(kuò)增和鑒定了CFTR基因的特異性重組質(zhì)粒。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素成功篩選獲得了CFTR基因抑制效果最顯著的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染上皮性卵巢癌細(xì)胞株。利用pAdEasy系統(tǒng)成功構(gòu)建重組腺病毒真核表達(dá)載體pAdTrace-CFTR-TOX，成功包裝獲得過表達(dá)人C

13、FTR基因的腺病毒，為進(jìn)一步研究CFTR惡性生物學(xué)行為及其分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第三部分.CFTR參與調(diào)節(jié)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移行為及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:探討CFTR對(duì)卵巢癌A2780、SKOV3細(xì)胞侵襲、遷移、增殖和粘附等一系列惡性生物學(xué)行為的影響及其可能分子機(jī)制。
　　方法:Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CFTRi細(xì)胞的遷移、侵襲能力變化。劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CFTR過表達(dá)細(xì)胞遷移能力的變化。細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)分

14、析CFTRi細(xì)胞的粘附能力改變。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)測(cè)定CFTRi細(xì)胞增殖能力改變。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察CFTRi細(xì)胞的克隆形成能力變化。裸鼠皮下移成瘤實(shí)驗(yàn)觀察CFTRi細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力變化，HE染色觀察裸鼠移植瘤組織形態(tài)學(xué)變化。重組腺病毒Ad-CFTR感染卵巢癌細(xì)胞A2780、SKOV3后，Western blot法檢測(cè)細(xì)胞src通路蛋白表達(dá)及其磷酸化形式的水平變化。
　　結(jié)果:
　?。?）Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，

15、CFTRi細(xì)胞的遷移能力受到抑制。
　　與對(duì)照組相比，約有63.11%的A2780-CFTRi細(xì)胞未能穿過基膜。而SKOV3-CFTRi細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，遷移能力減少了41.72%。
　?。?）Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CFTRi細(xì)胞的侵襲能力受到抑制。
　　與對(duì)照組相比，約有63.93%的A2780-CFTRi細(xì)胞未能穿過基膜。而SKOV3-CFTRi細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比，侵襲能力減少了60.89%

16、。
　?。?）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ad-CFTR感染后細(xì)胞遷移能力增加。
　　A2780-Ad-CFTR組比對(duì)照組遷移能力增加了39.5%，同樣的，SKOV3-Ad-CFTR組遷移程度比對(duì)照組增加39.3%。
　?。?）細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)顯示，CFTRi細(xì)胞的粘附能力顯著降低。
　　A2780-CFTRi細(xì)胞株粘附能力降低了約38.52%，而SKOV3-CFTRi粘附能力減少了42.31%。
　　（5）細(xì)胞增殖

17、實(shí)驗(yàn)顯示出了CFTRi細(xì)胞增殖能力的降低。
　　A2780?CFTRi和SKOV3-CFTRi細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比均表現(xiàn)出增殖能力的降低。
　?。?）平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明，CFTRi表現(xiàn)出克隆形成能力的降低。
　　A2780?CFTRi和SKOV3-CFTRi細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比均表現(xiàn)出克隆形成能力的降低。
　?。?）裸鼠皮下移成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CFTRi細(xì)胞移植瘤瘤體生長(zhǎng)速度緩慢，體積減小，移植瘤重量減少。HE染色

18、發(fā)現(xiàn)CFTRi組移植瘤細(xì)胞排列相對(duì)整齊。
　?。?）各組細(xì)胞總的c-Src和磷酸化-Src419(Tyr419)表達(dá)量的變化均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CFTR過表達(dá)的組細(xì)胞表現(xiàn)出了磷酸化-Src530(Tyr530)的激活。
　　結(jié)論:CFTRi卵巢癌細(xì)胞表現(xiàn)出了細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力、增殖能力和克隆形成能力和體內(nèi)成瘤能力的顯著抑制，Ad-CFTR感染后細(xì)胞表現(xiàn)出了遷移能力的增加，從正反兩方面證實(shí)了CFTR在上皮性卵巢癌侵襲遷移、增殖、