Rictor在卵巢癌腹腔侵襲轉(zhuǎn)移的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 Rictor促進卵巢癌腹腔侵襲轉(zhuǎn)移的研究
　　目的：研究雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2重要組成部分Rictor蛋白在調(diào)節(jié)卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移方面的作用及具體機制。
　　方法：免疫組織化學(xué)法檢測Rictor在不同組織分型卵巢癌組織標本及配對漿液性卵巢癌原位灶與轉(zhuǎn)移灶中的表達情況；建立并鑒定腹腔高轉(zhuǎn)卵巢癌細胞株；表達譜芯片確定高轉(zhuǎn)細胞株活化通路；轉(zhuǎn)染慢病毒表達的Rictor shRNA，穩(wěn)

2、定下調(diào)Rictor表達，通過Western blot、免疫熒光鑒定Rictor對卵巢癌細胞系上皮間質(zhì)化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）的影響；Transwell實驗鑒定Rictor下調(diào)后卵巢癌細胞體外轉(zhuǎn)移能力影響；斑馬魚轉(zhuǎn)移模型鑒定Rictor下調(diào)后，卵巢癌細胞體內(nèi)實驗轉(zhuǎn)移能力的影響；實時定量PCR、Western blot鑒定Rictor下調(diào)后經(jīng)典EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子變化；通過已有公開的臨床

3、卵巢癌病人表達譜數(shù)據(jù)確定Zeb1與Rictor相關(guān)性；Rictor下調(diào)后通過轉(zhuǎn)染Zeb1質(zhì)粒，Western blot檢測Zeb1對Rictor介導(dǎo)的EMT相關(guān)蛋白的影響，并用Transwell實驗檢測對卵巢癌細胞體外侵襲能力的影響；通過建立Nod/Scid卵巢癌原位模型，檢測Rictor對高轉(zhuǎn)移性卵巢癌細胞腹腔轉(zhuǎn)移的影響，免疫組織化學(xué)法檢測Rictor在體內(nèi)對EMT相關(guān)指標及轉(zhuǎn)錄因子Zeb1的影響；并通過生存分析檢測Rictor對小鼠

4、卵巢癌原位模型的生存的影響。
　　結(jié)果：Rictor在卵巢癌組織中高表達，并與卵巢癌的分級相關(guān)。Rictor在漿液型卵巢癌組織樣本中表達最為明顯，且在轉(zhuǎn)移灶中表達更高。成功建立腹腔高轉(zhuǎn)卵巢癌細胞株，此細胞株較親代低轉(zhuǎn)細胞發(fā)生上皮間質(zhì)化現(xiàn)象Ecadherin下調(diào)，且Rictor表達增加。經(jīng)shRNA干擾Rictor表達后，逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞發(fā)生的上皮間質(zhì)化過程，卵巢癌細胞的體外轉(zhuǎn)移能力降低，減少斑馬魚體內(nèi)轉(zhuǎn)移。Rictor對卵巢癌的上皮

5、間質(zhì)化過程是通過經(jīng)典轉(zhuǎn)錄因子Zeb1實現(xiàn)。Rictor下調(diào)后降低卵巢癌細胞在小鼠腹腔的轉(zhuǎn)移，在體內(nèi)逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞發(fā)生的上皮間質(zhì)化，延長卵巢癌原位模型的生存期。
　　結(jié)論：因此提出Rictor可通過Zeb1調(diào)控卵巢癌細胞的上皮間質(zhì)化過程，影響卵巢癌體內(nèi)體外的侵襲轉(zhuǎn)移，是抑制卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移的較好的分子靶點。通過深入了解Rictor如何影響卵巢癌的體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移，可以尋找影響Rictor的功能的可以獲得有效的卵巢癌腫瘤治療藥物，為治療卵巢

6、癌提供新的思路。
　　第二部分 條件性敲除Rictor的小鼠卵巢癌模型
　　目的：轉(zhuǎn)基因小鼠卵巢癌模型能非常近似模擬人類卵巢癌的發(fā)生過程，是研究人類卵巢癌發(fā)生機制的極佳工具。通過研究Kras/Pten卵巢癌小鼠模型的發(fā)生特點，尋找Rictor在轉(zhuǎn)基因小鼠卵巢癌模型發(fā)生中的作用。
　　方法：通過將Kras(G12D)小鼠與Pten(flox/flox)小鼠雜交，構(gòu)建Kras(G12D)Pten(flox/flox)基因型

7、小鼠。通過卵巢囊注射表達Cre酶的腺病毒，引起Kras(G12D)Pten(flox/flox)小鼠卵巢癌的發(fā)生。免疫組化鑒定小鼠卵巢癌病灶中mTOR通路指標及Rictor的變化。將Rictor（flox/flox)小鼠與Kras(G12D)Pten(flox/flox)小鼠雜交，構(gòu)建Kras（G12D）Pten(flox/flox)Rictor(flox/flox)基因型小鼠。
　　結(jié)果：成功建立Kras（G12D）Pten(f

8、lox./flox)基因型小鼠并誘發(fā)內(nèi)膜樣卵巢癌。mTOR通路相關(guān)指標及Rictor在Kras(G12D)Pten(flox/flox)基因型卵巢癌組織中表達升高。成功構(gòu)建Kras（G12D）Pten(flox/flox)Rictor(flox/flox)基因型小鼠。
　　結(jié)論：mTOR通路在Kras(G12D)Pten(flox/flox)基因型卵巢癌活化，Rictor表達升高，提示Rictor在卵巢癌的發(fā)生中起到作用。成功構(gòu)建

9、Kras（G12D）Pten(flox/flox)Rictor(flox/flox)小鼠為進一步研究Rictor在卵巢癌發(fā)生進展中的作用提供了基礎(chǔ)。
　　第三部分 mTOR抑制劑PP242與HDAC抑制劑SAHA通過凋亡與自噬協(xié)同殺傷卵巢癌細胞
　　目的：組蛋白去乙?；潜碛^遺傳學(xué)的一個重要組成部分，在卵巢癌的發(fā)生與進展中的經(jīng)常發(fā)生，影響相應(yīng)基因功能。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白酶（mTOR)在卵巢癌中也是較常見的活化激酶，通過聯(lián)

10、合應(yīng)用組蛋白乙酰化酶抑制劑SAHA與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白酶抑制劑PP242對卵巢癌細胞系進行體外與體內(nèi)殺傷，研究新的卵巢癌治療方法。
　　方法：利用CCK-8法檢測SAHA與PP242在不同濃度聯(lián)合下對卵巢癌細胞系SKOV3、A2780的增殖抑制效應(yīng)，并通過計算機軟件CalcuSyn計算兩者之間的協(xié)同效應(yīng)指數(shù)（combination index，CI）。利用流式細胞儀檢測單獨與聯(lián)合藥物處理后的卵巢癌細胞凋亡情況，Western

11、Blot法檢測凋亡標志性蛋白PARP與Caspase-3的表達與變化情況。卵巢癌細胞通過轉(zhuǎn)染慢病毒表達GFP標記的LC3蛋白后，進行藥物處理，熒光顯微鏡下檢測GFP-LC3聚集點的情況以反映細胞在藥物處理下的自噬效應(yīng)。Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3與P62蛋白的變化情況。通過原位注射卵巢癌細胞系于NOD/SCID免疫缺陷小鼠，建立卵巢癌原位模型，并進行藥物單獨與聯(lián)合治療以評估藥物對體內(nèi)腫瘤的殺傷效應(yīng)。
　　結(jié)果：

12、聯(lián)合應(yīng)用SAHA與PP242能夠明顯增強體外腫瘤增殖抑制效應(yīng)，該效應(yīng)CI值小于1，表明其為協(xié)同效應(yīng)。流式細胞儀檢測凋亡可明顯發(fā)現(xiàn)SAHA與PP242聯(lián)合后凋亡顯著增加，該凋亡是通過經(jīng)典Caspase-3/PARP凋亡通路引起。SAHA與PP242聯(lián)合后顯著增加PP242引起的自噬體的形成，自噬相關(guān)蛋白LC3在聯(lián)合藥物處理組顯著轉(zhuǎn)化為LC3B，P62蛋白明顯上調(diào)。免疫缺陷小鼠卵巢癌原位模型中，藥物聯(lián)合組顯著抑制卵巢癌腫瘤細胞增殖，并明顯延