禽源SP-A蛋白的原核表達(dá)及其部分抗菌活性研究.pdf

1、I摘要SPA（surfactantproteinASPA）蛋白是肺泡上皮分泌的一種親水性糖蛋白，該基因的表達(dá)在機體呼吸系統(tǒng)先天性免疫防御中發(fā)揮重要作用。與哺乳動物SPA的研究相比，家禽SPA的研究較為滯后。到目前為止，僅在基因庫注冊了雞SPA（chickensurfactantproteinAcSPA）前體mRNA基因序列，有關(guān)cSPA蛋白的組織分布、功能及其免疫機制研究還未見相關(guān)報道。本研究的主要目標(biāo)是通過基因工程的方法獲得cSPA蛋

2、白，從而為cSPA蛋白的深入研究及臨床應(yīng)用做好鋪墊，主要包括以下幾個方面內(nèi)容。首先，根據(jù)已注冊的cSPA前體mRNA基因序列設(shè)計一對引物，提取健康120日齡三黃雞的肺組織總RNA，進(jìn)行RTPCR，產(chǎn)物連接到pEASYBlunt并測序。測序結(jié)果與GenBank上登陸的cSPA前體mRNA100%同源，利用生物信息學(xué)軟件對cSPA氨基酸序列進(jìn)行分析并進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明cSPA具有C型凝集素家族的共同結(jié)構(gòu)特征，通過與其他哺乳動物SPA比較

3、，發(fā)現(xiàn)cSPA的糖識別結(jié)構(gòu)域（carbohydraterecognitiondomain，CRD）區(qū)較為保守，推測是與病原微生物發(fā)生凝集或粘附反應(yīng)的主要功能區(qū)。其次，根據(jù)cSPA的CRD編碼區(qū)基因序列，在不影響其蛋白結(jié)構(gòu)的情況下，參考大腸桿菌對密碼子的偏嗜性，將部分堿基突變，人工合成該基因插入到pMD19T載體中，再亞克隆到pGEX6P1載體中進(jìn)行原核表達(dá)，通過對條件優(yōu)化，成功高效表達(dá)了cSPACRD重組蛋白。再次，對SPACRD重組蛋

4、白進(jìn)行純化，以純化后的蛋白作為抗原腹腔注射小鼠制備抗cSPA多克隆抗體，ELISA檢測抗體效價，Westernblot法、免疫熒光組織化學(xué)染色和ELISA鑒定該抗體的特異性和適用范圍。試驗結(jié)果獲得了效價達(dá)到105的鼠抗cSPA血清；Westernblot法結(jié)果表明該多抗血清具有良好的特異性和反應(yīng)原性，并可用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測雞肺上皮細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞等組織表達(dá)的cSPA蛋白和用間接ELISA檢測雞肺灌洗液中存在的水溶性cSPA蛋白

5、。最后，對cSPACRD重組蛋白切膠回收，并用蛋白回收試劑盒純化，純化后的蛋白分別進(jìn)行平板凝集試驗和瓊脂孔穴擴散抑菌試驗。結(jié)果表明cSPACRD重組蛋白，在鈣離子的參與下能夠凝集禽傷寒沙門氏菌多價抗原；瓊脂孔穴擴散抑菌法檢測結(jié)果顯示cSPACRD蛋白對金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、乙型副傷寒（CMCC50094）、大腸桿菌（CMCC44102）及巴氏桿菌等也均有一定的抑菌活性。綜上所述，cSPA蛋白具有一般SPA蛋白的結(jié)構(gòu)特征，