禽源鮑曼不動(dòng)桿菌的分離鑒定與OmpA蛋白的原核表達(dá)及其初步應(yīng)用.pdf

1、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumanii,Ab）是醫(yī)院內(nèi)分離率位居第二的常見(jiàn)于人類感染的非發(fā)酵菌。其常會(huì)造成嚴(yán)重的醫(yī)院內(nèi)感染，包括皮膚和軟組織的感染、傷口感染、泌尿系統(tǒng)感染、繼發(fā)性腦膜炎、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎和菌血癥等并導(dǎo)致人類死亡。然而對(duì)于動(dòng)物源鮑曼不動(dòng)桿菌引起的動(dòng)物感染或者帶菌情況的報(bào)道遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒(méi)有人類多，尤其禽類感染鮑曼不動(dòng)桿菌的情況鮮有報(bào)道，故探明其在禽類的感染率或者有否人源菌株感染禽類等流行病學(xué)情況具有重要的現(xiàn)實(shí)和公

2、共衛(wèi)生意義。本課題首次開(kāi)展了不動(dòng)桿菌在家禽中感染情況的調(diào)查研究，并對(duì)流行菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。此外，通過(guò)對(duì)外膜蛋白A（Omp A）進(jìn)行原核表達(dá)，分析其免疫原性，并基于此建立了間接ELISA方法，以及進(jìn)行了初步應(yīng)用。
　　本研究對(duì)2014年9月至2015年10月的發(fā)病蛋雞的肝臟、脾臟、肺、氣管和十二指腸等450份病料進(jìn)行鮑曼不動(dòng)桿菌的分離鑒定。對(duì)分離菌進(jìn)行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特性的觀察、生化試驗(yàn)、藥敏試驗(yàn)、小鼠致病性試驗(yàn)和特異性基因檢測(cè)

3、，結(jié)果共分離到2株鮑曼不動(dòng)桿菌，流行率僅0.44％（95%CI,0.1-1.6）。2株鮑曼不動(dòng)桿菌均對(duì)多種抗生素耐藥，且對(duì)小鼠有較強(qiáng)的致病性，LD50均達(dá)到7.09×107CFU/0.5mL。這為研究鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)禽類的致病性以及其感染的流行情況等提供了材料基礎(chǔ)。
　　為了更好的認(rèn)識(shí)禽源鮑曼不動(dòng)桿菌的遺傳進(jìn)化地位及其溯源，本研究基于管家基因recA、gyrB、rpoB結(jié)合16S rRNA基因?qū)?株禽源分離株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表

4、明，進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)2株禽源分離株與人源鮑曼不動(dòng)桿菌遺傳距離最近，與大腸桿菌遺傳距離最遠(yuǎn)，核苷酸同源性分析顯示禽源分離菌核苷酸同源性均與人源鮑曼不動(dòng)桿菌的最高，高達(dá)92%-99.9%。以上結(jié)果說(shuō)明禽源分離菌可能由人源菌株進(jìn)化而來(lái)，這顯示了重要的公共衛(wèi)生意義。證明了recA、gyrB、rpoB基因聯(lián)合16S rRNA基因可用于不動(dòng)桿菌屬菌種鑒定，探索了一種鑒定該菌的新方法。
　　通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增Omp A基因，克隆至原核表達(dá)載

5、體pET28a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Omp A，轉(zhuǎn)化至BL21菌體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)條件摸索，確定最佳誘導(dǎo)條件，之后采用瓊脂糖Ni柱純化重組蛋白，并對(duì)其進(jìn)行Western blot分析。SDS-PAGE結(jié)果表明，在37℃經(jīng)0.4mmol/L IPTG誘導(dǎo)5h的條件下，重組菌株能表達(dá)出約41kDa的融合蛋白，與預(yù)期大小一致。Western blot分析顯示，該融合蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性。以上結(jié)果為進(jìn)一步建立快速簡(jiǎn)便的免疫學(xué)檢