2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構(gòu)建肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, S.pn)sp2108、sp0148基因的原核表達載體,表達并純化相應的重組蛋白,分析其在6株國內(nèi)常見 S.pn血清型菌株中的保守性;并將單個蛋白質(zhì)抗原經(jīng)不同途徑免疫 C57BL/6小鼠,檢測特異性抗體 IgG、IgA效價后,用不同血清型的S.pn攻毒免疫小鼠,從而探討 S.pn表面蛋白SP2108及SP0148對小鼠感染S.pn的保護作用,評價該表面蛋白對肺炎鏈

2、球菌感染的保護效果,為開發(fā)更有效的S.pn蛋白疫苗提供實驗依據(jù)。
  方法:利用PCR法擴增全長sp2108、sp0148基因,將其分別克隆至pCold TF和ppSUMO質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)后IPTG誘導蛋白表達,經(jīng)Ni-NTA親和層析純化獲得較高純度的目的蛋白;將純化重組蛋白免疫 C57BL/6小鼠制備多克隆抗體,ELISA法檢測特異性 IgG效價后,通過 Western Blotting鑒定其在6種常

3、見S.pn血清型菌株中的保守性。為了評估 SP2108、SP0148兩種重組蛋白對不同血清型 S.pn感染的保護效果,本實驗用上述制備的純化重組蛋白抗原經(jīng)腹腔皮下多點注射免疫 C57BL/6小鼠,然后選擇國內(nèi)常見3種血清型的肺炎鏈球菌進行腹腔攻毒研究。為了評價 SP0148重組蛋白抗原對 C57BL/6小鼠鼻腔感染 S.pn后的保護效果,通過模擬 S.pn自然感染的途徑,經(jīng)鼻腔滴注免疫小鼠后,用19F型菌株構(gòu)建鼻咽部定植模型,以評價其抗

4、S.pn定植的能力;同時選擇S.pn中致病能力最強的D39菌株進行鼻腔攻毒,以構(gòu)建S.pn致死性肺炎的小鼠模型。此外,本實驗采用特異性Anti-SP0148血清被動注入小鼠腹腔后,用 D39型菌株進行腹腔攻毒,以鑒定 SP0148重組蛋白抗原的保護效應是否由其特異性抗血清介導。最后,本實驗通過 D39型菌株對肺癌 A549細胞粘附抑制實驗,以分析不同濃度 SP0148重組蛋白及不同滴度 anti-SP0148血清對D39粘附于A549細

5、胞的影響。
  結(jié)果:成功構(gòu)建和表達SP2108、SP0148重組蛋白,Western Blotting分析證實, D39(2型)、TIGR4(4型)、CMCC( B)31693(19F型)、CMCC( B)31207(6B型)、CMCC( B)31203(3型)、ATCC(BAA-255) R6(2型)等6種S.pn菌株均能表達上述2種目的蛋白。經(jīng)腹腔皮下免疫接種SP2108重組蛋白后,未能對C57BL/6小鼠腹腔感染D39型S

6、.pn提供免疫保護效應;而SP0148重組蛋白在腹腔免疫和粘膜免疫C57BL/6小鼠中均顯示出明顯的保護效果,且能夠提高小鼠生存百分比,延長其生存時間。被動免疫研究提示SP0148抗血清對小鼠腹腔感染S.pn具有明顯的保護作用。
  粘附抑制實驗證實,不同濃度SP0148重組蛋白和不同滴度的Anti-SP0148均能抑制D39型S.pn對A549細胞的粘附,且呈劑量依賴關(guān)系。此外,通過SP0148重組蛋白體外刺激鼻腔滴注該蛋白的小

7、鼠脾細胞,可引起細胞因子IL-17A和IFN-γ水平明顯上升,而細胞因子IL-4、IL-10的水平未發(fā)生明顯變化。在構(gòu)建的S.pn感染定植的小鼠模型中,SP0148重組蛋白通過鼻腔粘膜途徑免疫C57BL/6小鼠,能有效減少19F型S.pn在鼻咽部粘膜及肺組織的定植。
  結(jié)論:SP0148、SP2108重組蛋白在不同血清型S.pn中均具有保守性高、免疫原性強等優(yōu)點。本研究首次通過腹腔及鼻腔兩種不同途徑免疫C57BL/6小鼠,并進一

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