2型豬鏈球菌ZnuA和Hlp重組蛋白的制備及其免疫學(xué)特性研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是重要的人獸共患病病原體,可引起人和豬患腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥甚至急性死亡,給養(yǎng)豬業(yè)和從業(yè)人員健康均帶來(lái)巨大威脅。1998年和2005年,在我國(guó)江蘇省和四川省分別暴發(fā)了S.suis2感染人和豬的公共衛(wèi)生事件,患者中出現(xiàn)國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)的鏈球菌中毒性休克綜合征(STSS)癥狀,該疫情引起了公共衛(wèi)生領(lǐng)域的高度重視。雖然疫苗的研制是控制S.suis感染的重要手段,但是目前尚未開(kāi)發(fā)出用

2、于預(yù)防S.suis感染的有效疫苗。
　　 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境變化中具有一系列不同的功能,為細(xì)菌輸入生存所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),輸出有毒物質(zhì)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在一些病原菌的致病過(guò)程中起到重要的作用,而且許多定位于細(xì)菌表面的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有免疫原性和免疫保護(hù)性。因此,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在疫苗開(kāi)發(fā)中具有潛在的價(jià)值。鋅是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的一種重要微量元素,鋅的吸收對(duì)于細(xì)菌在外界環(huán)境和宿主體內(nèi)的生存、繁殖至關(guān)重要。在細(xì)菌中,鋅ABC轉(zhuǎn)運(yùn)

3、蛋白ZnuABC不僅參與鋅的運(yùn)輸,還在多種病原菌的致病過(guò)程中起到非常重要的作用。
　　 本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)S.suis2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33基因組中存在ZnuABC編碼基因,其中細(xì)胞表面鋅離子結(jié)合蛋白znuA與多種細(xì)菌的鋅錳離子結(jié)合脂蛋白具有較高的序列同源性。以S.suis2中國(guó)強(qiáng)毒株05ZYH33基因組為模板,PCR擴(kuò)增znuA基因并克隆到pET32a載體并轉(zhuǎn)化到E.coli,原核表達(dá)出ZnuA,并利用His親

4、和層析獲得較高純度的重組蛋白。Westernblot分析和ELISA結(jié)果表明,ZnuA具有良好的免疫原性,是一種在S.suis2感染過(guò)程中表達(dá)的蛋白。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,ZnuA是一個(gè)S.suis2菌體表面蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,ZnuA重組蛋白對(duì)BALB/c小鼠具有良好的免疫保護(hù)作用,ZnuA可作為一個(gè)預(yù)防S.suis感染的亞單位疫苗候選分子。此外,基于ZnuA重組蛋白,初步建立了S.suis2感染的血清學(xué)檢測(cè)方法。
　　 本

5、課題組前期研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)全局性毒力負(fù)調(diào)控因子CovR,CovR調(diào)控多個(gè)毒力相關(guān)基因的表達(dá),其中溶血素樣蛋白基因hlp的表達(dá)發(fā)生上調(diào)。本研究的第二部分,首先從05ZYH33基因組中擴(kuò)增基因hlp,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a::hlp,轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3),原核表達(dá)出Hlp重組蛋白。His親和層析獲得較高純度的Hlp重組蛋白后,利用重組蛋白免疫新西蘭兔,獲得較高效價(jià)的抗血清。
　　 以上研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展ZnuA和h