豬鏈球菌2型強(qiáng)毒株重要功能蛋白的克隆表達(dá)、功能鑒定及其免疫特性研究.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一種重要的人畜共患病病原體，豬鏈球菌感染不僅可導(dǎo)致豬腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、敗血癥和猝死癥，并可導(dǎo)致從業(yè)人員感染出現(xiàn)中毒性休綜合癥、腦膜炎及敗血癥等嚴(yán)重疾患。國內(nèi)外的研究主要集中于S.suis 2的毒力相關(guān)因子，但也僅涉及一些功能性鑒定，新的毒力因子不斷被發(fā)現(xiàn)并有待進(jìn)一步探討。本課題開展了豬鏈球菌2型(S.suis 2)05ZYH33烯醇化酶(Enolase)、Su

2、ilysin和Hemolysin的研究。 1、豬鏈球菌2型Enolase 對(duì)新近測定的S.suis 205ZYH33全基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，設(shè)計(jì)合成引物，原核克隆表達(dá)并純化出具有酶活性的S.suis 205ZYH33 Enolase。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)Enolase可部分存在S.suis 205ZYH33的表面。黏附競爭實(shí)驗(yàn)證實(shí)S.suis 2表面Enolase參與對(duì)宿主細(xì)胞的黏附。溶血空斑實(shí)驗(yàn)提示E

3、nolase可能抑制免疫反應(yīng)。PCR檢測eno在S.suis各血清型中普遍存在。Westemblot表明Enolase具有較高的反應(yīng)原性，由此基于Enolase建立了S.suis2 ELISA抗體檢測方法。Enolase作為一個(gè)潛在的毒力因子為進(jìn)一步探索S.suis 2的致病機(jī)理提供了思路。 2、豬鏈球菌2型Suilysin 利用PCR技術(shù)從S.suis 205ZYH33基因組DNA中擴(kuò)增suilysin序列，構(gòu)建pET

4、32a：suilysin原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)，重組菌在37℃誘導(dǎo)4h時(shí)表達(dá)產(chǎn)物最多。以包涵體形式存在的重組蛋白經(jīng)尿素溶解、His-Tag親和層析純化和谷胱甘肽復(fù)性后，溶血實(shí)驗(yàn)表明其具有溶血活性，且活性受溫度、二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、過氧化氫、蛋白酶K等一些理化因素的影響。免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示出Suilysin對(duì)Balb/e小鼠有一定的保護(hù)作用，有可能作為S。suis2疫苗的侯選分子。 3、

5、豬鏈球菌2型Hemolysin 本實(shí)驗(yàn)在對(duì)S.suis 205ZYH33進(jìn)行全基因組序列測定、ORF預(yù)測和功能注釋的基礎(chǔ)上，對(duì)05ZYH33中的05SSU1668編碼基因進(jìn)行系統(tǒng)預(yù)測和分析，發(fā)現(xiàn)其具有信號(hào)肽和跨膜區(qū)，主要由DUF21、CBS和CorC-HlyC三部分組成。同源性分析表明與很多菌中具有溶血活性的蛋白具有較高的相似性。由此構(gòu)建了pET30a：hemolysin原核表達(dá)質(zhì)粒，為深入探討Hemolysin的溶血活性及其在