豬鏈球菌9型國內(nèi)分離株的毒力特性分析.pdf

1、豬鏈球菌(Streptococcus suis，SS)是一種重要的人畜共患病病原，根據(jù)菌體莢膜多糖抗原性的不同，分為35個(gè)血清型(1-34型，1/2型)。世界范圍內(nèi)以SS2流行最廣，致病性最強(qiáng)。 豬鏈球菌2、7、9型是國內(nèi)外豬鏈球菌感染的常見血清型，為了快速準(zhǔn)確地分析大量樣本中上述3個(gè)血清型的流行情況，根據(jù)GenBank發(fā)表的三個(gè)型的莢膜多糖合成相關(guān)基因設(shè)計(jì)合成三對(duì)引物，建立三重PCR檢測(cè)方法.利用此方法對(duì)廣東省2個(gè)屠宰場(chǎng)的16

2、0份樣本進(jìn)行檢測(cè)，并驗(yàn)證三重PCR的特異性及敏感性，結(jié)果表明，160份扁桃體樣本中檢出3株SS9，12株SS2；對(duì)未檢出的樣本再次用單個(gè)PCR進(jìn)行檢測(cè)，并未發(fā)現(xiàn)有漏檢的樣本，該三重PCR只對(duì)2、7、9三個(gè)血清型具有特異性，該三重PCR檢測(cè)豬鏈球菌其它血清型及其它鏈球菌結(jié)果均為陰性。敏感極限為500CFU/每個(gè)反應(yīng)。所建立的三重PCR特異性強(qiáng)，敏感性好，可用于對(duì)大量樣本的流行病學(xué)調(diào)查。 國外對(duì)豬鏈球菌毒力因子的研究發(fā)現(xiàn)SS2菌株有

3、多種基因型，致病性最強(qiáng)的基因型為cps2+/epf+/mrp+/sly+。而SS9分離株的毒力基因分布情況尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)國內(nèi)7株SS9分離株7種主要毒力基因一谷氨酸脫氫酶(gdh)、莢膜多糖合成相關(guān)基因(cps)、溶菌酶釋放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纖連蛋白/血纖蛋白原結(jié)合蛋白(fpbs)和毒力相關(guān)基因orf2，設(shè)計(jì)與合成7對(duì)引物，進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示：1株腦膜炎分離株G20565表現(xiàn)為cps9H

4、+/gdh+/epf-/mrp+/sly-/fbps+/orf2+，扁桃體分離株中僅1株表現(xiàn)為cps9H+/gdh+7epf-/mrp+/sly-/fbps+/orf2-，其它表現(xiàn)為cps9H+/gdh+/epf-/mrp-/sly-/fbps+/orf2-。通過對(duì)7株SS9的cps9H的300bp堿基測(cè)序，并將所測(cè)序列用laser軟件進(jìn)行同源性分析和進(jìn)化樹繪制，比對(duì)結(jié)果說明，病豬腦脊液分離株與扁桃體分離株莢膜基因存在明顯差異。

5、 為比較SS9不同來源菌株間的毒力差異，用7株SS9國內(nèi)分離株和1株SS9參考株22083以及SS2分離株HA9801對(duì)ICR小鼠進(jìn)行毒力預(yù)試驗(yàn)，選擇對(duì)小鼠有毒力的G20565和GD0606測(cè)定半數(shù)致死量，并比較G20565和GD0606以及GD0627之間的交叉保護(hù)性。結(jié)果顯示：G20565和GD0606能夠致死小鼠，兩株細(xì)菌均能引起典型的腦膜炎臨床癥狀，并能夠從腦脊液中分離到這2株細(xì)菌；而其它扁桃體分離株以及SS9參考株22083，

6、SS2強(qiáng)毒株臥9801對(duì)小鼠均不致死，也無可見臨床癥狀；可見小鼠可區(qū)分SS9菌株間的毒力差異，不適于SS2感染的動(dòng)物模型。對(duì)小鼠有毒力的G20565和GD0606具有mrp+epf-基因表型，而對(duì)小鼠無毒力扁桃體分離株均未檢測(cè)到mrp基因，表明mrp基因差異與SS9毒力差異有相關(guān)性。滅活的G20565菌株免疫小鼠對(duì)同源菌株G20565及GD0606的攻擊免疫保護(hù)率均為100％(10/10)，而滅活的GD0606和未滅活的GD0627對(duì)G

7、D0606攻擊免疫保護(hù)率分別為80％(8/10)和50％(5/10)，對(duì)G20565攻擊的免疫保護(hù)率分別為60％(6/10)和30％(3/10)。 用SS9腦膜炎分離株GZ0565扁桃體分離株SH040917和SS2分離株HA9801靜脈攻擊廣東某地土種豬，每株細(xì)菌各攻擊3頭豬。將以上菌株滅活后免疫廣東某地土種豬，每株細(xì)菌免疫3頭豬，GZ0565免疫紐用HA9801攻擊，HA9801免疫組用GZ0565攻擊，SH040917免疫

8、組用GZ0565攻擊。結(jié)果顯示：5×106CFU的HA9801攻擊的3頭豬均在16h內(nèi)死亡；GZ0565攻擊的豬發(fā)生關(guān)節(jié)炎，但未有豬死亡；SH040917未引起豬死亡，也未見典型臨床癥狀。GZ0565免疫組對(duì)HA9801產(chǎn)生一定保護(hù)力，但不完全，2/3保護(hù)，SH040917免疫組對(duì)GZ0565保護(hù)率1/3，2/3豬有關(guān)節(jié)炎。滅活的HA9801免疫組在GZ0565攻擊后，未有關(guān)節(jié)炎，僅部分試驗(yàn)豬剖解后有器官病變?？梢姡篠S9腦膜炎分離株G