豬鏈球菌2型江蘇分離株溶血素基因缺失株的構建及特性分析.pdf

1、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）能引起豬腦膜炎、關節(jié)炎、敗血癥甚至死亡，也可導致生豬從業(yè)人員的感染和死亡，是一種重要的人獸共患病病原體。根據(jù)莢膜多糖的抗原性差異，豬鏈球菌分35個血清型，其中豬鏈球菌2型(SS2)分布最廣，分離率最高，致病性最強。
　　 豬鏈球菌溶血素(亦稱豬溶素，簡稱SLY)，是SS2的一種重要毒力因子。SLY陽性菌株的流行存在一定地域性，北美分離株的溶血素陽性率明顯低于歐洲、亞洲分離株。

2、提示我們?nèi)苎卦诓煌赜虻呢i鏈球菌的致病過程中可能發(fā)揮不同的功能。
　　 目前對溶血素的生物學功能和致病機理還不十分明確。除了可以肯定SLY能溶解多種動物的紅細胞及對多種細胞有毒性作用外，對溶血素如何誘導細胞因子表達、如何在豬鏈球菌?。ㄓ绕湓谀X膜炎）的發(fā)生和發(fā)展起作用，還有待于進一步的深入研究。
　　 本研究對國內(nèi)病豬中豬鏈球菌2型分離株的溶血素基因進行了檢測及序列分析，明確了其分布及遺傳變異情況;并通過原核表達全長溶血

3、素及其生物學特性及免疫原性的研究、豬鏈球菌2型江蘇分離株溶血素基因缺失株的構建及其生物學特性與致病性分析，對溶血素的生物學功能、尤其是對其分子致病機理進行了較為深入的研究。
　　 1國內(nèi)病豬中豬鏈球菌2型分離株溶血素基因的PCR檢測及序列分析
　　 通過聚合酶鏈反應(PCR)方法檢測29株不同年代、不同地區(qū)豬鏈球菌2型(SS2)國內(nèi)病豬分離株的溶血素基因（sly），并將其中的5株(SS2-1、HA9801、HA0507、

4、JR0507和ZY05719)的sly進行克隆及序列分析。結果顯示:29株菌都有sly，其中5株菌的sly的ORF的堿基數(shù)目都為1，494 bp、編碼497個氨基酸，核苷酸序列的同源性為99.7％～100.0％，所推導的蛋白質(zhì)序列的同源性為99.8％～100.0％，其中SS2-1、HA9801、HA0507、JR0507與國外參考株P1/7的序列完全一致。表明中國豬鏈球菌2型病豬分離株普遍具有sly，且基因序列極為保守。
　　

5、2.豬鏈球菌2型溶血素全長基因的原核表達及其生物學特性與免疫原性研究
　　 根據(jù)豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）溶血素的基因序列，設計引物，以江蘇分離株SS2-1的基因組為模板，擴增出除信號肽序列外的sly全長基因，并定向克隆到表達載體pET-32α中，轉化大腸桿菌BL21(DE3)。重組菌經(jīng)1mM IPTG誘導，在37℃下，4h時表達產(chǎn)物（分子量約為72kDa）達到高峰，表達量約占菌體總蛋白20％，表達產(chǎn)

6、物在上清和包涵體中各占一半。將上清經(jīng)鎳柱親和層析純化，純化蛋白經(jīng)Westernblotting鑒定呈陽性，對綿羊紅細胞、雞紅細胞的溶血效價分別為1.707×105HU/mg、4.267×104HU/mg，并可引起HEp-2和Vero細胞的融合、顆粒增多和脫落。純化蛋白對BALB/c小鼠的免疫保護性為83.3％(5/6)。這為進一步研究SLY致病機理和研制豬鏈球菌新型疫苗奠定了基礎。
　　 3.豬鏈球菌2型江蘇分離株溶血素基因缺失

7、株的構建
　　 以豬鏈球菌2型江蘇分離株JR0507為模板，分別擴增溶血素基因的569bp、559bp的上下游同源臂，以pSET3為模板，擴增了長度為1056bp的氯霉素基因，將三者依次與自殺性質(zhì)粒pSET4S質(zhì)粒進行連接，將連接產(chǎn)物轉化入DH5α感受態(tài)中，構建了基因缺失載體pSET4sΔSLY。然后將構建的載體pSET4sΔSLY通過電轉化導入JR0507的感受態(tài)細胞中，利用氯霉素抗性進行初步篩選，并用PCR和Western

8、blotting進行鑒定，結果成功構建了溶血素基因缺失株JR0507（ΔSLY），為進一步研究豬鏈球菌溶血素的功能奠定了基礎。
　　 4.豬鏈球菌2型江蘇分離株溶血素基因缺失株的生物學特性及致病性分析
　　 對構建好的溶血素基因缺失株JR0507(ΔSLY)與親本株JR0507的各項生物學特性及致病性進行了比較研究。結果表明，JR0507（ΔSLY）已完全失去了溶血活性。與親本株相比較，其生長特性、生化特性、對PK-15

9、、HEp-2和PIEC細胞的粘附能力沒有發(fā)生變化，但對這3種細胞的毒性作用都呈極顯著下降。缺失株在全血中的存活率為（15.5±2.8）％，親本株為（40.7±4.8）％，呈極顯著下降(P＜0.01)。動物致病性試驗表明，ΔSLY對BALB/c小鼠的MLD為1.0×109CFU，比親本株上升了10倍，同時△SLY對新西蘭兔和斷乳仔豬都失去了致病性。用細菌接種3D4豬肺泡巨噬細胞6h后，2株菌都不能誘導炎癥相關細胞因子（IL-1β、IL-1