馬鏈球菌獸疫亞種類M基因缺失株的構(gòu)建及生物特性分析.pdf

1、馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi ssp.zooepidemicus，SEZ)對(duì)集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展危害嚴(yán)重，同時(shí)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的相關(guān)從業(yè)人員的健康具有潛在威脅，類M蛋白是該菌一種重要的表面蛋白和毒力因子，具有調(diào)理素功能，且能夠抵抗的吞噬細(xì)胞對(duì)其的吞噬作用。本試驗(yàn)構(gòu)建了類M蛋白基因(szp)的缺失株，在分子水平上對(duì)馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的粘附機(jī)制進(jìn)行了研究，同時(shí)，通過(guò)動(dòng)物模型評(píng)價(jià)了該突變株的毒力和免疫原性。因此本研究所構(gòu)

2、建的ATCC35246的類M蛋白基因缺失突變?nèi)醵揪?，為該菌的致病機(jī)制及引起的豬鏈球菌病的防控進(jìn)行了有益的探索。 1.鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株類M蛋白基因缺失株的構(gòu)建 根據(jù)已發(fā)表的馬鏈球菌獸疫亞種豬源ATCC35246株的類M蛋白基因序列，設(shè)計(jì)和合成一對(duì)基因步移引物，并以ATCC35246株的基因組DNA為模板，通過(guò)基因步移技術(shù)，擴(kuò)增出類M蛋白左右兩翼基因。為了敲除類M蛋白基因，以ATCC35246為始發(fā)菌株，

3、構(gòu)建基因重組質(zhì)粒PUC-18，利用同源重組的原理構(gòu)建了ATCC35246的類M蛋白基因缺失突變菌株(缺失了類M蛋白基因共1090bp)并對(duì)該菌株的致病力、小鼠模型的免疫保護(hù)作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，ATCC35246的類M蛋白基因缺失突變菌株對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的致病性明顯減弱；突變株能對(duì)小鼠提供良好的免疫保護(hù)，半定量RT-PCR示，免疫鼠IL-2、IFN-γ基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高.所以經(jīng)免疫的小鼠可以獲得良好的被動(dòng)免疫保護(hù)作用。為了進(jìn)一步確定s

4、zp基因的具體作用，進(jìn)行了馬鏈球菌獸疫亞種szp基因缺失株的基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)基因互補(bǔ)株與野生株的生物特性基本一致。因此本研究所構(gòu)建的ATCC35246的szp基因缺失突變?nèi)醵揪昕勺鳛轭A(yù)防ATCC35246感染的疫苗候選株，為最終研究制出馬鏈球菌獸疫亞種鏈球菌的基因工程菌苗奠定基礎(chǔ)。 2.類M蛋白及其基因缺失株對(duì)HEp-2細(xì)胞的粘附作用 采用通用的模式細(xì)胞HEp-2細(xì)胞，研究馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246株類M

5、蛋白的粘附作用。結(jié)果顯示，用重組的ATCC35246株類M蛋白預(yù)處理HEp-2細(xì)胞，當(dāng)類M蛋白的量達(dá)到3.2μg/200μL，可顯示為陽(yáng)性；用重組表達(dá)的類M蛋白單抗處理類M蛋白，可抑制其對(duì)HEp-2細(xì)胞的粘附，在1.8μg/500μL能完全抑制它對(duì)HEp-2細(xì)胞的粘附，說(shuō) 明其單抗對(duì)應(yīng)的抗原表位在細(xì)胞粘附中具有決定性作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，親本株及szp基因缺失株均對(duì)HEp-2細(xì)胞有黏附和侵襲力，但szp基因缺失株黏附能力降低50％以上