粘膜免疫ClpX蛋白對(duì)小鼠肺炎鏈球菌感染的保護(hù)效果及機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pn)定植于人類上呼吸道粘膜表面，能引起肺炎、腦膜炎、敗血癥等一系列疾病，在全球范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率和病死率。隨著抗生素耐藥形勢(shì)的日趨嚴(yán)峻，疫苗在預(yù)防肺炎鏈球菌感染性疾病中的作用愈發(fā)重要。
　　肺炎鏈球菌ClpX屬于HSP100/Clp(酪蛋白水解酶)家族，作為ATP酶亞單位與蛋白酶亞單位ClpP組成ClpXP復(fù)合物，有分子伴侶功能，在熱應(yīng)激耐受、

2、底物識(shí)別等過程中發(fā)揮著重要的作用，與肺炎鏈球菌的生存、毒力密切相關(guān)，同時(shí)生物信息學(xué)提示該蛋白可能表達(dá)于細(xì)菌胞外，提示ClpX可能是一個(gè)較好的疫苗候選蛋白。因此，本研究旨在探討ClpX粘膜免疫對(duì)肺炎鏈球菌的保護(hù)效果及其機(jī)制，評(píng)估其作為疫苗候選蛋白的可行性。
　　方法：
　　利用原核表達(dá)技術(shù)從大腸埃希菌中表達(dá)出S.pn ClpX蛋白(全長(zhǎng))，純化后免疫BALB/c小鼠制備特異性多克隆抗血清。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)S.pn中ClpX在細(xì)胞

3、內(nèi)外的表達(dá)情況，并利用所制備的anti-ClpX多克隆抗血清，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)及Western blot對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析驗(yàn)證；PCR及Western blot分析ClpX在9種不同血清型肺炎鏈球菌中的保守性；ELISA測(cè)定肺炎鏈球菌感染患兒、健康兒童以及健康成人血清中ClpX特異性IgG效價(jià)；以霍亂毒素(Cholera Toxin，CT)為佐劑，純化重組ClpX(rClpX)蛋白經(jīng)鼻腔粘膜免疫BALB/c小鼠，ELISA測(cè)定免疫后小鼠

4、血清及唾液中特異性抗體效價(jià)及亞型，以及脾細(xì)胞經(jīng)刺激后細(xì)胞因子的分泌水平。以S.pn CMCC31693(19F型)進(jìn)行鼻腔攻毒，于攻毒第5天取小鼠鼻腔灌洗液，計(jì)數(shù)細(xì)菌載量；以S.pn D39(2型)及CMCC31614(14型)分別進(jìn)行鼻腔攻毒，監(jiān)測(cè)小鼠生存率。
　　結(jié)果：
　　成功構(gòu)建pET-28(a)-clpX重組質(zhì)粒，經(jīng)表達(dá)純化后獲得純度>90％的重組ClpX蛋白；生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)ClpX可能為分泌型蛋白，流式細(xì)胞術(shù)

5、結(jié)果表明ClpX不表達(dá)于S.pn表面；分離細(xì)菌亞組分進(jìn)行Western blot分析，ClpX在S.pn培養(yǎng)上清中檢測(cè)出來，提示其為分泌型表達(dá)；PCR及Western blot結(jié)果顯示，9種不同血清型S.pn中ClpX均保守存在；健康兒童血清中ClpX特異性抗體水平高于同年齡組S.pn患兒，且該抗體水平呈現(xiàn)年齡依賴性增長(zhǎng)；與對(duì)照組相比，純化rClpX蛋白粘膜免疫小鼠能有效刺激機(jī)體血清及唾液中產(chǎn)生高滴度的IgG及IgA水平(P<0.01)

6、，且血清中的IgG以IgGl及IgG2b為主；另外，粘膜免疫rClpX還能有效刺激機(jī)體脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IL-17A和IL-4(P<0.05)；不同血清型S.pn粘膜攻毒結(jié)果顯示，粘膜免疫rClpX能顯著降低19F型S.pn在鼻咽部的定植(P<0.001)，提高2型(P<0.05)和14型(P<0.01)S.pn攻毒后小鼠的生存率。
　　結(jié)論：
　　肺炎鏈球菌ClpX蛋白為分泌型蛋白，在不同血清型S.pn菌株保守性好，在人體