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文檔簡介
1、目的:
肺炎鏈球菌莢膜(Capsule CPS)是肺炎鏈球菌的一種重要的毒力因子,在細菌定植、粘附中發(fā)揮重要作用,可保護細菌免受宿主的吞噬殺傷作用。肺炎鏈球菌莢膜合成基因為一操縱子結(jié)構(gòu),即cps基因座,其表達水平受其上游啟動子的調(diào)控,但目前尚不清楚有哪些蛋白可通過該啟動子調(diào)控這些基因及CPS的合成。
我們前期研究通過DNA pulldown實驗篩選到CcpA可能與肺炎鏈球菌莢膜多糖(CPS)基因座啟動子區(qū)域結(jié)合,且C
2、cpA(catabolite control protein A,CcpA)是一種與糖代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,調(diào)控了肺炎鏈球菌多種基因的表達。本研究擬通過EMSA實驗驗證CcpA與cps啟動子序列的結(jié)合,并進一步研究其對莢膜的調(diào)控作用,為了解肺炎鏈球菌莢膜合成的分子機制提供新的實驗證據(jù)。
方法:
利用大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)工程菌原核表達CcpA蛋白,使用 Ni2+親和層析的方法
3、純化目的蛋白。利用純化后的CcpA蛋白免疫昆明小鼠并制備多克隆抗體;采用ELISA法測定抗CcpA抗體效價。隨后,利用Westertn blot方法分析CcpA蛋白在肺炎鏈球菌中的保守性。另外,利用EMSA方法分析CcpA與cps基因座啟動子區(qū)域片段的結(jié)合。最后,采用基因重組方法構(gòu)建ccpA基因缺失株和ccpA基因回復(fù)株;利用ELISA法測定野生D39菌株、ccpA基因缺失株和ccpA基因回復(fù)株的莢膜多糖含量。
結(jié)果:
4、 首先得到了高純度(>90%)的CcpA重組蛋白且制備了CcpA多克隆抗體,Western blot結(jié)果顯示CcpA蛋白在多種血清型的肺炎鏈球菌均有表達。EMSA實驗結(jié)果顯示,CcpA蛋白可與cps基因座啟動子區(qū)域結(jié)合,且呈劑量依賴性;ccpA基因缺失時,細菌CPS含量升高,回復(fù)表達CcpA蛋白后,CPS含量顯著降低。
結(jié)論:
我們的結(jié)果表明,CcpA是肺炎鏈球菌中一種保守表達的蛋白,可通過與cps基因座啟動子特異
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