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文檔簡介
1、在脊椎動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育史中,性別決定和性別分化是兩個(gè)重要的過程,細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)對高等動(dòng)物的性別決定影響較大,占有重要地位。而對于魚類等低等脊椎動(dòng)物,性腺分化受到溫度、光照、激素等多方面的影響。小體鱘(Acipenser ruthenus)隸屬于鱘科(Acipenseridae)鱘亞科(Acipenserinae),鱘屬(Acipenser),有洄游和定棲兩種類型,主要分布于里海、黑海、亞速海、地中海、歐洲國家和我國的新疆地區(qū)。小體鱘個(gè)體小、
2、生長慢、性成熟早,雌魚懷卵量在0.2~7萬粒/kg,是目前鱘養(yǎng)殖業(yè)中良好的雜交親本,適合大水面養(yǎng)殖,具有良好的養(yǎng)殖前景。
芳香化酶(P450arom)是脊椎動(dòng)物體內(nèi)催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的限速酶,其表達(dá)高峰期在出生前后,性成熟后降至最低。雌激素在性別分化、生長、發(fā)育、繁殖及雌性性征維持上起重要作用。大多數(shù)脊椎動(dòng)物中,P450arom由CYP19單基因編碼,魚類中存在兩種不同基因(CYP19a1a和CYP19a1b)編碼的P45
3、0arom,分為性腺型芳香化酶(P450arom A)和腦型芳香化酶(P450arom B),在組織中的分布也不同。雄激素受體(androgen receptor,AR)是一種配體依賴型受體,通過與雄激素結(jié)合發(fā)揮其作用。雄激素是一種類固醇激素,在芳香化酶的作用下轉(zhuǎn)化為雌激素,是所有雌激素的前體物質(zhì)。能影響動(dòng)物的行為及其生殖系統(tǒng)的發(fā)育、分化、成熟和維持。
本實(shí)驗(yàn)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、RACE以及相對熒光定量等技術(shù)克隆得到
4、小體鱘P450和AR基因全長,以及P450和AR mRNA在小體鱘雌性性腺發(fā)育的二期、三期、四期和雄性性腺發(fā)育三期的不同組織中的表達(dá)差異,為小體鱘精巢和卵巢發(fā)育的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ),也為該魚的內(nèi)分泌以及生殖調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
1、小體鱘芳香化酶(P450)基因的克隆及表達(dá)分析
采用同源克隆和RACE的方法,從小體鱘腦中分離得到芳香化酶(P450)基因。P450 cDNA全長1893bp,包括5′端6
5、9 bp的非編碼區(qū)(untranslation region, UTR),1340 bp的開放閱讀框ORF(open reading finder)和3′端455 bp的非編碼區(qū)(不包括ploy A的尾巴)。P450前體蛋白由446個(gè)氨基酸組成,理論分子質(zhì)量為50.11 kD。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn):小體鱘P450與史氏鱘(Acipenser schrenckii) P450同源性最高,達(dá)到98%,與鯔魚(Mugil cephalus)、大
6、西洋鱈魚(Gadus morhua)、海鱒(Salmo trutta)、底鳉(Fundulus heteroclitus)等魚類的卵巢型方向化酶(cyp19a1a)的同源性在63%~66%,與鯔魚、半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、青鳉(Oryzias latipes)等魚類的腦型方向化酶(cyp19a1b)的同源性在58%~63%。相對熒光定量(RT-PCR)表明
7、:P450 mRNA的表達(dá)具有明顯的組織特異性,在雌性二期、三期、四期中,卵巢中P450表達(dá)量明顯高于其他組織,其次是腦、肌肉、腎臟,鰓、腸和心臟中的表達(dá)量最低。在雄性三期中,表達(dá)量最高的是腦,其次是性腺和腎。
2、小體鱘雄激素受體(AR)基因的克隆及表達(dá)分析
采用同源克隆和RACE的方法,從小體鱘二期卵巢中分離得到了雄激素受體(AR)的cDNA序列,AR基因cDNA全長為2953 bp,包括5′端68 bp的非編碼
8、區(qū)(untranslation region, UTR),2528 bp的開放閱讀框ORF(open reading finder)和3′端327 bp的非編碼區(qū)(不包括ploy A的尾巴)。AR前體蛋白由843個(gè)氨基酸組成,理論分子質(zhì)量為94.24 kD。同源比較結(jié)果表明,小體鱘AR氨基酸序列與其他魚類的AR氨基酸序列同源性較高,與雜交鱘(Acipenser ruthenus x Huso huso)、西伯利亞鱘(Acipenser
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