半滑舌鰨性別相關(guān)基因DAZL和WT1a的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）因具有生長(zhǎng)快、口感鮮美、市場(chǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，是一種理想的增養(yǎng)殖對(duì)象。但是半滑舌鰨雌性的生長(zhǎng)速度是雄性的2-3倍，且存在天然的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，性逆轉(zhuǎn)后的偽雄魚(yú)繁殖能力差，后代偽雄魚(yú)比例高。因而研究半滑舌鰨的性別決定機(jī)制，實(shí)現(xiàn)單性育種對(duì)于半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。本文克隆了半滑舌鰨DAZL和WT1a基因，發(fā)現(xiàn)它們均是半滑舌鰨性別相關(guān)基因。通過(guò)研究這兩個(gè)基因的表達(dá)情況，尤其是與性

2、腺分化早期的組織學(xué)觀察結(jié)合起來(lái)，不僅有利于闡明DAZL基因和WT1a基因在ZZ/ZW型魚(yú)類(lèi)的性腺分化中的作用，而且為找出半滑舌鰨性別決定的關(guān)鍵控制基因以及實(shí)現(xiàn)全雌育種提供基礎(chǔ)材料和理論依據(jù)。
　　本文通過(guò)組織切片觀察半滑舌鰨性腺的分化和發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)該批仔魚(yú)雌性性腺在46天之前雄魚(yú)性腺分化不明顯。56天時(shí)，雌性仔魚(yú)性腺開(kāi)始出現(xiàn)不規(guī)則的溝壑，出現(xiàn)卵巢腔，說(shuō)明性腺開(kāi)始分化，并且雄性性腺的分化晚于雌性性腺。另外對(duì)成魚(yú)的性腺切片觀察發(fā)現(xiàn)性

3、逆轉(zhuǎn)后的雌魚(yú)性腺中有大量的精子，且與正常雄魚(yú)的性腺切片差異不大。
　　本研究利用RACE技術(shù)克隆了半滑舌鰨DAZL基因的全長(zhǎng)。通過(guò)測(cè)序和拼接獲得了半滑舌鰨DAZL基因的cDNA序列2026bp，含有636bp的完整開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼211個(gè)氨基酸，編碼產(chǎn)物含有典型的RNA識(shí)別基序RRM和DAZ重復(fù)序列。熒光定量PCR結(jié)果顯示，DAZL基因在半滑舌鰨性腺特異表達(dá)，并且DAZL基因在雄魚(yú)中的表達(dá)量顯著高于雌魚(yú)和偽雄魚(yú)，但在雌魚(yú)

4、和偽雄魚(yú)性腺中表達(dá)量差異不大，說(shuō)明DAZL基因并不是性逆轉(zhuǎn)的標(biāo)志性基因，在生理性別為雄性的偽雄魚(yú)性腺中仍然保持正常雌魚(yú)的表達(dá)模式。在胚胎發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)結(jié)果顯示，DAZL基因在受精后20h（神經(jīng)胚期）之前表達(dá)量較高，并在20h達(dá)到最高值，而20h以后表達(dá)迅速降低，可能是20h以后原始生殖細(xì)胞的形成導(dǎo)致。在仔魚(yú)發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)結(jié)果顯示，DAZL在仔魚(yú)發(fā)育25d至65d表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，并且在雌魚(yú)46d時(shí)出現(xiàn)顯著升高，在雄魚(yú)56d時(shí)出現(xiàn)顯著

5、升高，與仔魚(yú)的性腺的分化時(shí)期相吻合。這些結(jié)果說(shuō)明，DAZL基因是半滑舌鰨性別特異基因，但并沒(méi)有參與性反轉(zhuǎn)的過(guò)程，并且可能在半滑舌鰨性腺的分化過(guò)程中起重要作用。
　　本文從半滑舌鰨全基因組序列中獲得 WT1a的部分序列，然后利用同樣的方法克隆了WT1a基因的全長(zhǎng)?？寺〗Y(jié)果顯示：WT1a基因全長(zhǎng)cDNA為1886bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)為1470bp，編碼490個(gè)氨基酸，并且包含 KTS三肽，5'UTR和3'UTR分別長(zhǎng)為245b

6、p和171bp。在ORF末端發(fā)現(xiàn)2個(gè)微衛(wèi)星（SSR）序列和2個(gè)跨膜螺旋區(qū)域，而在其他物種中未發(fā)現(xiàn)該序列，經(jīng)驗(yàn)證該序列在半滑舌鰨中普遍存在，這可能是半滑舌鰨所特有的。氨基酸序列分析顯示W(wǎng)T1a基因的保守性很高，與人的同源性也高達(dá)90％。熒光實(shí)時(shí)定量分析結(jié)果顯示：WT1a在雌魚(yú)和雄魚(yú)性腺中表達(dá)顯著高于其它各組織，并且在雄魚(yú)性腺中的表達(dá)顯著高于雌魚(yú)，在雌魚(yú)性腺中的表達(dá)又顯著高于偽雄魚(yú)，說(shuō)明該基因是性別相關(guān)基因。在胚胎發(fā)育各時(shí)期以及初出膜后的表