半滑舌鰨(Cynoglossu semilaevis)兩種抗菌肽和細(xì)胞因子Midkine的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、本研究以實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的半滑舌鰨cDNA文庫為基礎(chǔ)，利用RACE技術(shù)、染色體步移等技術(shù)篩選出半滑舌鰨兩種抗菌肽hepcidin、NK-lysin以及一種細(xì)胞因子Midkine基因全長，并通過研究這三個(gè)基因的序列，基因結(jié)構(gòu)，正常組織、發(fā)育時(shí)期和免疫刺激下的表達(dá)情況，體外表達(dá)及活性檢測等方面，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)將主要研究結(jié)果分述如下：
　　 半滑舌鰨CsHepcidin cDNA序列由171 bp5’-UTR，291 bp OR

2、F和151 bp3’-UTR組成，預(yù)計(jì)編碼96個(gè)氨基酸殘基的前體，該前體由信號(hào)肽，前體肽和成熟肽組成，成熟肽具有保守的8個(gè)半胱氨酸殘基。hepcidin基因全長由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，內(nèi)含子2存在一個(gè)三堿基ACA重復(fù)的微衛(wèi)星。序列、基因組結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析均表明CsHepcidin是魚類hepcidin1家族成員。熒光定量PCR顯示CsHepcidin在各組織中均有不同程度的表達(dá)，其中在肝臟和腦中表達(dá)量較高，而在胚胎和仔魚發(fā)育過程中，

3、孵化后6 d CsHepcidin顯著增加，而在變態(tài)期則明顯降低，暗示CsHepcidin的表達(dá)受半滑舌鰨胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)，并可能參與半滑舌鰨變態(tài)期發(fā)生的復(fù)雜的生理生化過程。鰻弧菌免疫刺激后，CsHepcidin在肝臟、脾臟和頭腎中的表達(dá)都有顯著增加，表明CsHepcidin可能在半滑舌鰨對(duì)外界刺激和病原生物侵襲的防御過程中有不可忽視的作用。為研究CsHepcidin的抗菌活性，本研究成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a(+)-HEP，并轉(zhuǎn)

4、化進(jìn)宿主菌BL21(DE3)pLysS，成功誘導(dǎo)表達(dá)可溶性的重組蛋白HEP，純化的重組蛋白對(duì)多種菌株的生長都有不同程度的抑制作用，尤其是對(duì)海洋致病菌鰻弧菌、遲緩愛德華氏菌等效果比較明顯，而對(duì)革蘭氏陽性菌株金黃色葡萄球菌的抗菌能力則較弱。
　　 半滑舌鰨抗菌肽NK-lysin基因全長1516 bp，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，其cDNA序列全長683 bp，包括5’-UTR47 bp，ORF408 bp和3’-UTR228 bp

5、，預(yù)計(jì)編碼135個(gè)氨基酸殘基組成的分泌性蛋白，成熟肽具有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基以及一個(gè)SAPLIP家族典型特征的Saposin B結(jié)構(gòu)域。同源性分析表明CsNK-lysin與牙鲆、大西洋鮭的一致性較高，而與牛、馬、豬和雞的NK-lysin則很低。CsNK-lysin保守的蛋白結(jié)構(gòu)、序列特征和相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)暗示CsNK-lysin可與入侵病原菌相互作用，并顯示抗菌活性。本研究中發(fā)現(xiàn)由于內(nèi)含子4的不正常剪切，半滑舌鰨中CsNK-lysin存

6、在三種剪切型，三者的C端序列存在幾個(gè)氨基酸殘基的差異。熒光定量PCR顯示CsNK-lysin三種剪切型的組織表達(dá)具有一定相似性，均在小腸和心臟中表達(dá)水平較高。鰻弧菌免疫刺激后，CsNK-lysin三種剪切型在小腸、脾臟和頭腎中的表達(dá)呈現(xiàn)不同模式，表明CsNK-lysin可能參與半滑舌鰨的非特異性免疫過程，但具體的調(diào)控機(jī)理尚不明確。
　　 半滑舌鰨細(xì)胞因子Midkine基因全長3541 bp，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成。CsMi

7、dkine cDNA序列全長1098 bp，包括5’-UTR159 bp，3’-UTR504 bp以及ORF435bp，預(yù)計(jì)編碼144個(gè)氨基酸殘基組成的分泌性蛋白，成熟肽富含半胱氨酸和堿性氨基酸，具有典型的Pleiotrophin/Midkine家族的結(jié)構(gòu)特征。CsMidkine基因的5’側(cè)翼鄰接甘油二酯激酶基因，并存在視黃酸受體結(jié)合位點(diǎn)、類固醇/甲狀腺激素受體結(jié)合位點(diǎn)、Sp1、GATA-1、Mef，C/EBP等多種潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位

8、點(diǎn)。熒光定量PCR顯示CsMidkine在成魚腦組織中特異性表達(dá)，而在半滑舌鰨胚胎發(fā)育過程中，CsMidkine表達(dá)量在原腸胚中期開始顯著增加，在神經(jīng)胚和腦部分化時(shí)期其表達(dá)都有顯著變化。整體原位雜交顯示CsMidkine主要集中在胚胎頭部表達(dá)，在未來的間腦、中后腦邊界(MHB)和后腦一直存在高強(qiáng)度的雜交信號(hào)，個(gè)別區(qū)域信號(hào)變化，如神經(jīng)管。從表達(dá)時(shí)間、表達(dá)分布結(jié)合系統(tǒng)進(jìn)化樹綜合分析，推測半滑舌鰨CsMidkine屬于MKb分支，參與半滑舌鰨