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1、抗菌肽(antimicrobial peptides)是一種具有廣譜抗菌活性的小分子多肽,目前已發(fā)現(xiàn)了大約1900種,幾乎存在于所有的物種中。這種多肽具有分子量小、熱穩(wěn)定性好、免疫原性較低、抗菌范圍廣、不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小等諸多優(yōu)點,在人和動物病害防治中具有重要的應(yīng)用潛力。本研究以實驗室已構(gòu)建好的半滑舌鰨Hepcidin成熟肽的原核表達(dá)菌株為基礎(chǔ),對80個重組菌株進(jìn)行了篩選,通過比較80個菌株蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖譜,篩選出
2、了蛋白表達(dá)量最多的菌株。對高效表達(dá)菌株的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化,比較了該菌株在不同誘導(dǎo)時間、不同誘導(dǎo)溫度、不同誘導(dǎo)時機和不同誘導(dǎo)劑濃度下表達(dá)的目的蛋白SDS-PAGE圖譜,得到最佳表達(dá)條件是:誘導(dǎo)時機為OD600=0.6-0.7,誘導(dǎo)溫度為30℃,誘導(dǎo)時間為10 h,誘導(dǎo)劑濃度為1.0 mM。
將實驗室已獲得的半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)Hepcidin和NK-lysin成熟肽編碼基因分別連接到分泌型載
3、體 pINA1317和胞內(nèi)表達(dá)型載體pINA1312中,然后將這兩種表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia lipolytica)Po1h構(gòu)建真核表達(dá)系統(tǒng),通過測序的結(jié)果以及對酵母基因組序列的PCR擴增,證明了兩種表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化均取得了成功。載體pINA1317和pINA1312質(zhì)粒的啟動子是都是hp4d,不需要任何物質(zhì)誘導(dǎo)就可以表達(dá)外源基因,而解脂耶羅維亞酵母具有安全性高,生產(chǎn)的成本低,表達(dá)的蛋白活性高等優(yōu)點。半滑舌
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