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1、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)能代謝產(chǎn)生多種抗菌活性物質(zhì),具有抗細(xì)菌、真菌、病毒的功能,能夠防治多種植物病害。其中,LI-F類抗菌脂肽是一種天然的廣譜抗菌物質(zhì),由于其具有安全、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),在食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用潛力巨大。然而,野生型菌種的產(chǎn)量很低,使生產(chǎn)成本增加,導(dǎo)致LI-F類脂肽不能大規(guī)模生產(chǎn),從而限制了其工業(yè)化應(yīng)用。
本研究以多粘類芽孢桿菌JSa-9為出發(fā)菌株,采用多種選育方式提高其產(chǎn)
2、LI-F類抗菌脂肽的能力,以期得到性質(zhì)穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株,為今后其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究成果如下:
1.采用制備液相方法對(duì)多粘類芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)LI-F抗菌脂肽建立定量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。通過(guò)制備液相色譜得到脂肽LI-F的純品,純度在93%以上。脂肽LI-F檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=3401x-280.9,其線性相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9991,通過(guò)計(jì)算得知多粘類芽孢桿菌JSa-9發(fā)酵液中LI-F類抗菌脂肽的產(chǎn)量為88.19mg/L。
3、r> 2.通過(guò)物理和化學(xué)方法對(duì)多粘類芽孢桿菌JSa-9誘變選育,獲得高產(chǎn)LI-F類抗菌脂肽的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。分別采用亞硝基胍、60Co-γ射線和低能氮離子束注入三種誘變方法對(duì)其進(jìn)行誘變處理,通過(guò)致死率和正突變率統(tǒng)計(jì),確定NTG最佳誘變濃度為50μg/mL;60Co-γ射線的最優(yōu)輻照劑量為200Gy;低能氮離子束最佳注入劑量為20keV,注入時(shí)間30s。經(jīng)過(guò)點(diǎn)植對(duì)照法和生長(zhǎng)譜法篩選鑒定,得到了兩株?duì)I養(yǎng)缺陷型菌株N1-37和N2-27,分
4、別為苯丙氨酸缺陷型和組氨酸缺陷型。與野生菌株相比,N1-37和N2-27菌株的發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性分別提高了45.54%和32.35%,對(duì)串珠鐮孢菌的抑菌活性分別提高了23.12%和21.85%,對(duì)尖鐮孢菌的抑菌活性分別提高了18.08%和15.59%。N1-37和N2-27的脂肽LI-F產(chǎn)量分別是野生菌JSa-9的1.71倍和1.4倍。
3.對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株N1-37和N2-27進(jìn)行原生質(zhì)體融合技術(shù)研究。制備原生
5、質(zhì)體的最佳條件為:對(duì)數(shù)期種子液經(jīng)過(guò)二次轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)8h收集菌體;溶菌酶濃度為0.1mg/mL;酶解溫度37℃;酶解時(shí)間7min;酶解后原生質(zhì)體形成率均達(dá)到了97%以上,再生率均大于30%。PEG6000誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的最佳條件:PEG6000濃度為40%,pH值為9.0,融合時(shí)間為15 min。經(jīng)過(guò)篩選獲得一株高產(chǎn)融合子F5-15。通過(guò)測(cè)定其發(fā)酵液其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性提高了84.70%,對(duì)串珠鐮孢菌抑菌活性提高了49.32%,
6、對(duì)尖鐮孢菌的抑菌活性提高了38.96%。產(chǎn)LI-F類抗菌脂肽的產(chǎn)量為野生菌的3.1倍。
4.以原始菌株JSa-9為對(duì)照,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)融合子F5-15的LI-F類抗菌脂肽合成酶基因fus A1、fus A2、fusC1和fus C2的表達(dá)進(jìn)行分析。首先采用Trizol法提取得到RNA,測(cè)定其R值為1.93,說(shuō)明所提RNA純度較高。之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以其為模板,以16S rDNA作為內(nèi)參基因,通過(guò)實(shí)時(shí)熒
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