改進(jìn)的“分子開關(guān)”技術(shù)在SNP位點(diǎn)CYP2C19-2和-3分型中的應(yīng)用.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?
　　 氯吡格雷(Clopidogrel)屬于吩噻吡啶類抗血小板藥物，在臨床上被廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的治療，但臨床上發(fā)現(xiàn)患者對氯吡格雷的藥物代謝存在顯著的個(gè)體差異，研究表明CYP2C19*2和*3位點(diǎn)的堿基多態(tài)性與藥物代謝相關(guān)，因此對這兩個(gè)位點(diǎn)的準(zhǔn)確分型對指導(dǎo)氯吡格雷個(gè)體化用藥有重要意義。本研究旨在建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作方便并且可用于大量篩查的SNP分型方法，為指導(dǎo)氯吡格雷個(gè)體化用藥打下基礎(chǔ)。
　　

2、 研究方法:
　　 1選擇基于“分子開關(guān)”的SNP基因分型方法。設(shè)計(jì)3'末端硫代修飾的特異性引物結(jié)合高保真Pfu酶，用已知基因型的DNA為模板摸索最佳擴(kuò)增條件，并探討3'末端單硫代修飾和雙硫代修飾引物對擴(kuò)增特異性的影響，最終建立穩(wěn)定的對CYP2C19*2和*3位點(diǎn)分型的方法。在此基礎(chǔ)上，對104例外周血標(biāo)本進(jìn)行CYP2C19*2和*3位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，并與測序結(jié)果相比較，以進(jìn)一步驗(yàn)證該方法可靠性。
　　 2鑒于單硫代修飾

3、引物特異性不足的缺陷，探討以Tth-SSB作為添加劑對反應(yīng)特異性的影響。構(gòu)建Tth-SSB質(zhì)粒，在表達(dá)純化出Tth-SSB后，首先確定其添加用于SNP分型的擴(kuò)增體系中的最佳用量，在此基礎(chǔ)上，考量其提高反應(yīng)特異性的效果。最后將其用于CYP3C19*2和*3位點(diǎn)進(jìn)行SNP分型，并與雙硫代修飾引物結(jié)果相比較。同時(shí)還探討了其他一些添加劑如二甲基亞砜、甜菜堿和海藻糖等對改進(jìn)反應(yīng)特異性的效果。
　　 研究結(jié)果:
　　 1建立了一種基

4、于雙硫代修飾結(jié)合高保真酶的SNP分型方法，利用該方法對104例外周血標(biāo)本CYP2C19*2(681G＞A)和CYP2C19*3(636G＞A)的分型結(jié)果與平行測序結(jié)果一致，表明該方法簡便、可靠，可用于臨床指導(dǎo)氯吡格雷的個(gè)體化用藥。
　　 2初步獲得蘇州地區(qū)CYP2C19*2位點(diǎn)三種基因型A/A、G/A、G/G頻率分別為8.65％、36.54％和54.81％; CYP2C19*3位點(diǎn)三種基因型A/A、G/A、G/G頻率分別為0.9

5、6％、9.62％和89.42％。
　　 3將1μg/25μL Tth-SSB添加到單硫代修飾引物的擴(kuò)增體系后，可杜絕非特異性擴(kuò)增，提高基因分型的準(zhǔn)確性。Tth-SSB可以提高基因分型反應(yīng)的特異性，并且對104例標(biāo)本檢測結(jié)果與雙硫代修飾引物檢測結(jié)果完全相同。
　　 4二甲基亞砜、甜菜堿、海藻糖添加到SNP基因分型擴(kuò)增體系中，對提高特異性的效果不明顯。
　　 結(jié)論:
　　 基于“分子開關(guān)”的SNP基因分型方法