應(yīng)用新型斷接式發(fā)夾探針技術(shù)檢測(cè)CYP2C8基因SNP的研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌的聯(lián)合化療是該病治療的主要方法之一，其對(duì)患者預(yù)后有顯著的改善作用，但化療的藥效和毒副作用在不同個(gè)體的差異顯著，研究表明這與單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）關(guān)系密切，但相關(guān)的多基因SNP與療效之間的精確關(guān)聯(lián)，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。發(fā)夾探針是一類適用于SNP等單個(gè)堿基突變檢測(cè)的重要工具，將發(fā)夾探針固定在載體表面可進(jìn)行多位點(diǎn)SNP檢測(cè)，但是作為發(fā)夾探針技術(shù)優(yōu)勢(shì)的熒光

2、共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）現(xiàn)象因在實(shí)際應(yīng)用中難以保留而使發(fā)夾探針的應(yīng)用受到較大的制約。為了解決這一問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外的主要改進(jìn)方法都是采用探針莖臂修飾的方式，但這種方式的技術(shù)難度較大，且運(yùn)用也受到一定的限制。為此，在本研究中，我們綜合各種改良設(shè)計(jì)的利弊，提出了新型斷端對(duì)接式發(fā)夾探針技術(shù)，以熒光素/淬滅素?cái)喽藢?duì)接/緊密接觸的方式，使探針原始核心技術(shù)-FRET現(xiàn)象以不同的

3、方式實(shí)現(xiàn);并結(jié)合納米磁珠的強(qiáng)大熒光信號(hào)富集放大效應(yīng)，建立基于斷接式發(fā)夾型探針結(jié)合磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng)，該技術(shù)使該探針的檢測(cè)效果更加優(yōu)化。
　　方法:
　　1.通過(guò)NCBI GenBank查得乳腺癌治療常用的聯(lián)合化療藥物紫杉醇、阿霉素在肝內(nèi)代謝的重要相關(guān)基因CYP2C8的序列，以該基因的原始序列和139A/G位點(diǎn)SNP突變序列分別作為后續(xù)試驗(yàn)用的原始靶序列和突變靶序列，并運(yùn)用生物信息學(xué)軟件根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)用于檢測(cè)CYP2C8基因S

4、NP突變的斷接式發(fā)夾探針。通過(guò)探針比例和雜交溫度摸索，最終確定檢測(cè)體系的最適探針濃度比和最適溫度，來(lái)區(qū)分靶序列和突變靶序列。
　　2.將上述獲得的斷接式發(fā)夾型DNA探針與納米磁珠進(jìn)行固定，建立斷接式發(fā)夾探針納米磁珠信號(hào)放大系統(tǒng)，并將固定斷接式發(fā)夾型DNA探針的納米磁珠收集在離心管中，進(jìn)行納米磁珠熒光信號(hào)富集的信號(hào)放大效果檢測(cè)，同時(shí)選取探針進(jìn)行標(biāo)記修飾，對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行條件優(yōu)化，并在熒光顯微鏡下觀察和比較靶序列和突變序列的熒光，摸索集合

5、磁珠檢測(cè)體系的最佳濃度和溫度以及時(shí)間。
　　3.收集50例乳腺癌患者的血液標(biāo)本，提取這些患者的全血基因組DNA，設(shè)計(jì)并合成CYP2C8基因139A/G SNP位點(diǎn)突變檢測(cè)引物，進(jìn)行人CYP2C8基因的PCR擴(kuò)增，并對(duì)CYP2C8基因片段進(jìn)行切膠回收;利用已經(jīng)成功建立的斷接式發(fā)夾型探針結(jié)合磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，明確新構(gòu)建方法臨床檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，并對(duì)其檢測(cè)效果進(jìn)行初步鑒定。
　　結(jié)果:
　　1.CYP2C8

6、基因序列第139個(gè)編碼氨基酸的堿基序列為AGG，發(fā)生SNP突變后為AAG。經(jīng)探針設(shè)計(jì)和條件摸索，CYP2C8的139A/G SNP檢測(cè)體系的最適雜交溫度為40℃，最佳探針比例為熒光探針P1:淬滅探針P2為1∶4，最佳雜交時(shí)間固定磁珠為2h，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的CYP2C8 SNP檢測(cè)體系對(duì)139A/G的突變檢測(cè)效果顯著。
　　2.成功構(gòu)建了以斷接式發(fā)夾型DNA探針為識(shí)別分子并固定的納米磁珠，且富集納米磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng)的檢測(cè)效果顯著，能夠更

7、高效、更靈敏地區(qū)分CYP2C8基因的SNP位點(diǎn)原始序列和突變序列的熒光信號(hào)強(qiáng)度，提示斷接式發(fā)夾型探針結(jié)合磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng)初步構(gòu)建成功。
　　3.提取乳腺癌患者DNA濃度較高，CYP2C8基因139A/G SNP位點(diǎn)突變序列擴(kuò)增效果良好，所得片段與設(shè)計(jì)引物時(shí)預(yù)期片段大?。?53bp左右）一致。斷接式發(fā)夾型探針結(jié)合磁珠的信號(hào)放大系統(tǒng)對(duì)CYP2C8基因139A/G SNP位點(diǎn)突變的檢測(cè)效果確切。
　　結(jié)論:
　　1.本研究